PCR实验技术

PCR基因扩增傅达奇[e-mail]010-62737538转102主要内容PCR的发现和应用PCR实验原理和实验步骤DNA，生命的蓝图PCR的发现KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，……1983年9月中旬，Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。Mullis的第一个PCR实验PCR的发展史1983年春，Mullis发展出PCR的概念；1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，TaqDNApolymerase，这是85年春天Mullis建议做的；1988年，第一台PCR仪问世；1991年，HoffmanLaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。Taq酶Taq酶是从水生栖热菌ThermusAquaticus（Taq）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。PCR不只是一个方法改进Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。PCR的应用领域生物学领域几乎无处不用基因、DNA片段的克隆人工基因构建DNA序列测定基因定点突变基因型（突变）检测，SNP分析，遗传背景分析生物物种鉴定，系统进化研究基因表达量研究（real-timePCR）/基因表达谱研究（DNAchip,SAGE）医学领域疾病基因检测/遗传病的产前诊断致病病原体的检测肿瘤治疗中癌基因的检测，会推广到大部分疾病治疗前的检测DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证其他:动、植物检疫（转基因动植物检测）PCR仪器的变迁三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）电加热块＋自来水冷却（PE，1988）电加热块＋内置循环液冷却（PE，1989）三个加热块＋机械手（Stratagene，1994）半导体制冷和加热（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）温度梯度,荧光检测(如Roche的Lightcycler)风加热Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈,厦门安普利等）实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。实验原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。PCR技术的原理1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的扩增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5’3’3’5’引物1互补链引物2互补链目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。ParameterConcentrationTemplatepHdNTPsGelatinPrimersMg2+oncentrationEnzymeTotalvolume10attomoles(~1×106molecules)8.4（10mMTris-Hcl）200μM(eachone)100g/ml(optional)0.5μM(eachone);(0.1—1.0μM)0.5mM10mM1unit25—100μl一般PCR反应条件实验仪器电泳仪琼脂糖凝胶电泳槽PCR仪凝胶成像系统移液器实验材料1、DNA模板2、4种dNTP3、引物1、引物24、Taq酶5、琼脂糖6、DNA相对分子质量标准物7、吸头、50ulPCR管试剂10×PCR缓冲液(含Mg2＋)4×dNTP(每种1mmol)Tag酶1U/ulDNA模板引物1:5`-GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3`引物2:5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3`引物溶液浓度10pmol/ul实验步骤1在0.5mlRCR管内配置20ul反应体系：CK(ul)1#(ul)模板01引物10.40.4引物20.40.410×PCRBuffer22Taq酶0.50.5dNTPs0.40.4ddH2O14.315.3Total2020PCR反应程序(1)94℃变性5min，(2)94℃变性1min，(3)56℃退火1min，(4)72℃延伸1min。(5)重复(2)-(4)30次（6）72℃延伸1min。实验报告要求：1、写出本实验目的、原理；2、实验器材及实验步骤；3、列出实验结果示意图并分析原因。