实验6紫外测定蛋白质的浓度吸收法

实验6紫外测定蛋白质的浓度吸收法一、目的1、了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。2、了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。二、原理由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。三、材料、试剂与器具（一）试剂1、标准蛋白溶液准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为1mg/mL的溶液。2、待测蛋白溶液配制成浓度约为1mg/mL的溶液。（二）器具1、紫外分光光度计。2、试管和试管架。3、吸量管。四、操作步骤（一）标准曲线法1、标准曲线的绘制按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。12345678标准蛋白质溶液/ml00.51.01.52.02.53.04.0蒸馏水/ml4.03.53.02.52.01.51.00蛋白质浓度/（mg/mL）00.1250.2500.3750.5000.6250.7501.00A2802、样品测定取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。（二）其他方法（1）将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。计算蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260式中A280和A260分别是蛋白质溶液在280nm和260nm波长下测得的光吸收值。此外，也可选计算出A280/A260的比值后，从表6-1中查出校正因子“F”值，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将“F”值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。表6-1紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子280/260核酸（%）因子（F）280/260核酸（%）因子（F）1.750.001.1160.8465.500.6561.630.251.0810.8226.000.6321.520.501.0540.8046.500.6071.400.751.0230.7847.000.5851.361.000.9940.7677.500.5651.301.250.9700.7538.000.5451.251.500.9440.7309.000.5081.162.000.8990.70510.000.4781.092.500.8520.67112.000.4221.033.000.8140.64414.000.3770.9793.500.7760.61517.000.3220.9394.000.7430.59520.000.2780.8745.000.682注：一般纯蛋白的光吸收比值（A280/A260）约为1.8，而纯核酸的比值约为0.5。280AN1蛋白质浓度(mg/mL)=Fd式中A280为该溶液在280nm下测得的光吸收值；d为石英比色杯的厚度（cm）；N为溶液的稀释倍数。（2）对于稀蛋白质溶液，还可用215nm和225nm的吸收差来测定浓度。从吸收差A与蛋白质含量的标准曲线即可求出浓度。吸收差215225AAA式中的A215和A225分别是蛋白质溶液在215nm和225nm波下测得的光吸收值。此法在蛋白质含量达20—100g/mL的范围内，是服从Beer定律的。氯化钠、硫酸铵以及1×10-1mol/L磷酸、硼酸和三羟甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用。但是1×10-1mol/L乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在215nm波长下的吸收较大，不能应用，必须降至5×10-3mol/L才无显著影响。由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH的改变而有高低，故应紫外吸收法时要注意溶液的pH，最好与标准曲线制订时的pH一致。（3）如果已知某一蛋白质在280nm波长处的吸收值[1%1cmA]，则取该蛋白质溶液于280nm处测定光吸收值后，便可直接求出蛋白质的浓度。五、实验报告根据测定结果，分析比较此法与其他蛋白质测定法在应用中的优缺点。六、思考题1、本法与其他测定蛋白质含量法相比，有哪些优缺点？2、若样品中含有干扰测定的杂质，应如何校正实验结果？