4第3章 灭菌法

灭菌法安徽中医学院药剂学教研室为什么要研究灭菌法什么是灭菌法主要的灭菌方法有哪些?灭菌可靠性是如何判定的影响湿热灭菌的因素有哪些湿热灭菌应注意问题有哪些违反操作规程灭菌带来的后果－－““欣弗欣弗””事件事件2006年8月15日,国家食品药品监督管理局召开新闻发布会，通报了对安徽华源生物药业有限公司生产的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液（欣弗）引发的药品不良事件调查结果：该公司2006年6月至7月生产的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液未按批准的工艺参数灭菌，降低灭菌温度，缩短灭菌时间，增加灭菌柜装载量，影响了灭菌效果。经中国药品生物制品检定所对相关样品进行检验，结果表明，无菌检查和热原检查不符合规定。因此，对灭菌温度、灭菌时间等工艺参数不得任意进行更改，需变更时，必须进行验证。注射染菌输液的后果在20世纪50～60年代，美国针剂细菌污染，败血症。到70年代，美国、欧洲静脉注射药剂导致败血症的案例增多。FDA跟踪调查静脉注射细菌污染的原因。在1970年至1973年间，FDA组成有工程师、检验专家和微生物学家参加的联合调查组，选了4家生产针剂的制药厂，对每家药厂的设施进行了全面的检验，并对6例败血症进行了跟踪调查静脉注射剂所受细菌污染的情况。通过这些检验，揭示了这些药厂在生产过程和质量控制过程中明显达不到GMP的有关规定。FDA不得不要求有关企业停产，进行设备改造，并将其在没有消毒保证下所生产的药品全部注销。教学内容第一节概述第二节物理灭菌法第三节化学灭菌法第四节无菌操作法第一节概述一、基本概念灭菌(sterilization)：应用物理或化学等方法将物体上或介质中所有微生物繁殖体及其芽孢全部杀灭或除去的手段。所用的灭菌方法称灭菌法(thetechniqueofsterilization)。无菌(sterility)：在任一指定的物体、介质或环境中无任何活的微生物。无菌操作(aseptictechnique)：在整个操作中利用或控制一定的条件，使产品避免被微生物污染的一项操作方法和技术。消毒(disinfection)：以物理或化学等方法杀灭物体上或介质中的病原微生物。消毒剂：对病原微生物具有杀灭或除去作用的物质。防腐(antisepsis)：用物理或化学等方法抑制微生物的生长与繁殖，亦称抑菌。防腐剂：对微生物的生长与繁殖具有抑制作用的物质，亦称抑菌剂。二、灭菌制剂与无菌制剂的定义与分类灭菌制剂：采用某一物理或化学方法将杀灭或除去所有活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。无菌制剂：采用某一无菌操作方法或技术制备的不含任何活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。分类注射用制剂：注射剂、输液、注射粉针等；眼用制剂：滴眼剂、眼用膜剂、软膏剂、凝胶剂等；植入型制剂：植入片等；创面用制剂：溃疡、烧伤及外伤用溶液、软膏剂、气雾剂等。手术用制剂，止血海绵剂和骨蜡等。1、F与F0值在灭菌中的意义与作用无菌检验往往难以检出极微量微生物，为了保证产品无菌，有必要对灭菌方法的可靠性进行验证是很必要的。主要原因：①灭菌温度多系测量灭菌器内的温度，不是灭菌物体内的温度；②无菌检验方法也在局限性，难以用现行的无菌检验法检出微量的微生物。二.灭菌参数2、D值为在一定温度下杀死被灭菌物品中微生物90％所需时间；也可定义为降低微生物一个十位数或一个对数值（如log100降低到log10）所需的时间。微生物致死曲线与D值微生物死亡速度属一级过程。dN/dt=-kt，即lgN0-lgNt=kt/2.303D=t=2.303(lg100-lg10)/kD值因微生物的种类、环境、灭菌温度不同而各异。3、Z值在不同温度下对特定的微生物在特定介质或环境中求得D值后，Z值为降低一个lgD值所需升高的温度数，即灭菌时间减少到原来的1/10时所需升高的温度或在相同灭菌时间内，杀灭99%的微生物所需要提高的温度。Z=(T2-T1)/(lgD2-lgD1)，即D2/D1=10(T2-T1)/Z4、F值与F0值F(或F0)值可作用验证灭菌可靠性的参数。(1)F值F为在一定温度(T)，给定Z值所产生的干热灭菌效果与参比温度(T0)给定Z值所产生的灭菌效果相同时所相当的时间(equivalenttime)，以分为单位。F=ΔtΣ10(T-T0)/ZΔt是测量被灭菌物温度的时间间隔，一般为0.5-1.0或更小，T是每个Δt测量被灭菌的温度，T0是参比温度。(2)F0值为在一定灭菌温度(T)、Z值为10℃所产生的湿热灭菌效果与121℃,Z值为10℃所产生的灭菌效果相同时所相当的时间(min)。物理F0=ΔtΣ10(T-121)/Z也就是说F0是将各种灭菌温度使微生物的致死力转换为灭菌物品完全暴露于121℃使微生物致死效力生物F0=D121×(lgN0-lgNt)Nt为灭菌后预计达到的微生物残存数，即染菌度概率(probabilityofnonsterility)，当Nt为10-6时(原有菌数的百万分之一)，可认为灭菌效果较可靠。由于F0是将不同灭菌温度折算到相当于121℃湿热灭菌时的效力，故F0值可作为灭菌过程的比较参数。为使F0测定准确，应选择灵敏度高，重现性好，精密度为0.1的热电偶并进行校验。灭菌时应将热电偶的探针置于被测物的内部,有些灭菌记录仪附有F0计算器，在灭菌过程中和灭菌后，自动显示F0值。为了确保灭菌效果，还应注意两个问题，根据F0=D121×(logN0-logNt)，若N越大，即被灭菌物中微生物越多，则灭菌时间越长，故生产过程中应尽量减少微生物的污染，应采取各种措施使每个容器的含菌数控制在10以下。其次计算F0时,应适当考虑增加安全因素,一般增加50％，如规定F0为8分，则实际操作应控制F0为12分。影响F0值的因素：①容器大小、形状及热的穿透性等。②灭菌产品溶液的性质、填充量等。③容器在灭菌器中的数量及分布等。灭菌法药剂学中灭菌法可分为三大类：即物理灭菌、化学灭菌、无菌操作法。第二节物理灭菌法(一)干热灭菌法一般认为繁殖型细菌在100℃以上干热1小时即被杀死。耐热性细菌芽孢在120℃以下长时间加热也不死亡，在140℃前后则杀菌效率急剧增长。(1)干热灭菌条件:有的药典规定为180℃，1小时以上；有的为160-170℃，2-4小时，此是大致的标准而已，必须通过实验，在保证灭菌完全同时对灭菌物品无损害的前提下，制订该物品的干热灭菌条件。(2)时间必须由灭菌物品全达到特定温度的计算。通常在电热干燥箱内进行。(3)适用于耐高温的玻璃制品、金属制品以及不允许湿气透的油脂类(如油性软膏基质、注射用油等)和耐高温的粉末化学药品等。(4)热原经250℃30分钟或200℃以上高温至少45分钟，可遭破坏。(5)缺点是穿透力弱，温度不易均匀，而且由于灭菌温度过高，不适用橡胶、塑料及大部分药品。(二)湿热灭菌法由于蒸气比热大，穿透力强，容易使蛋白变性，同时还有作用可靠，操作简便等优点，湿热灭菌法是应用最广泛的一种灭菌方法，本法包括热压灭菌法，流通蒸气灭菌法和低温间歇灭菌等方法。根据药品性质进行选用。1、热压灭菌法本法一般公认为最可靠的湿热灭菌法。应用大于常压的水蒸气如1kg/cm2热压蒸气以15-20分钟，能杀灭所有细菌增殖体和芽孢。热压灭菌所需的温度及与温度相当的压力及时间如下：(1)115℃，1.7atm(67kPa，7.1kg/cm2)，30min；(2)121℃，2.0atm(97kPa，11kg/cm2)，20min；(3)126℃，2.4atm(139kPa，14.1kg/cm2)，15min。湿热灭菌一般要求F0＝1－12分。热压灭菌适用于耐高温和耐高压蒸气的所有药物制剂、玻璃容器、金属容器、瓷器、橡皮塞、滤膜过滤器等。热压灭菌用的灭菌器种类很多，但其基本结构大同小异。热压灭菌器密闭耐压，有排气口安全阀，压力表和温度计等部件。有的通蒸气加热，有的用煤气、电热或木炭等加热。常用的有手提式热压灭菌器等。热压灭菌器使用时应注意的问题：(1)应先进行灭菌条件实验，确保灭菌效果。灭菌器的构造、被灭菌物体积、数量、排布均对灭菌的湿度有一定影响。(2)必须将灭菌器内的空气排出。如果灭菌器内的空气存在，则压力表上所表示的压力是灭菌器内蒸气和空气二者的总压而非单纯的蒸气压力。结果压力虽然到达预定的水平，但温度达不到。则有可能空气没有排尽，也可能压力表失灵，也可能不是饱和蒸气，应找出原因，加以解决。(3)灭菌时间必须由全部药液温度达到所要求的温度时算起，在开始升温时，要求一定的预热时间。例如250-500ml输液瓶，预热时间为15-30分钟。(4)灭菌完毕后，停止加热，一般必须使压力表所指示的压力逐渐下降到零，才能放出锅内蒸气，使锅内压力与大气压相等后，稍稍打开灭菌锅待10－15分钟，再全部打开。这样可避免内外压力差太大而使物品冲出锅外和使玻璃瓶炸裂。这点必须注意，以免发生工伤事故。为了缩短灭菌周期，也有对灭菌器内盛有溶液的容器喷雾水冷却，以加速冷却。