菌种的筛选和分离

工业微生物菌种的分离与筛选来源：青岛海博一、微生物工业对菌种的要求(一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。（二）、微生物工业对菌种的要求是：（1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;（2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;（3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;（4）能够高效地将原理转化为产品;（5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小;（6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;（7）在发酵过程中产生的泡沫要少;（8）具有抗噬菌体的能力；（9）遗传稳定性，二、工业用微生物菌种的来源及选育（一）微生物菌种的来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：（1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；（2）从大自然中采集样品分离；（3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。（二）微生物工业菌种的分离1、野生菌株的分离、筛选过程（1）新菌种分离与筛选的步骤菌种分离的流程如下：标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。②标本预处理④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定，⑥毒性试验：据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。2、菌种的分离方法（1）施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。（2）随机分离方法有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。Ｂ、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。Ｃ、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。（3）目的微生物分离A、根据形态筛选突变株B、根据平板菌落生化反应筛选变株透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。①透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养基中加入碳酸钙，使平板成混状，将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养，由于产生菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈，可以轻易地鉴别出来。分离乳酸产生菌时，由于乳酸是一种较强的有机酸，因此，在培养基中加入的碳酸钙不仅有鉴别作用，还有酸中和作用。②变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。如筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为惟一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在pH6.2～7.6，当pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。③生长圈法：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌（如E.coliP264）与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。④抑菌圈法：常用于抗生素产生菌的分离筛选，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。实验十从自然界中分离筛选微生物菌种1目的（1）学习并掌握优良曲霉菌的分离原理和方法。（2）学习工掌握酸乳中乳酸菌的分离原理和方法。2原理从自然界中分离筛选微生物菌种，是我们获得优良新菌种最基本、最主要的方法，因此，食品工业菌种的分离筛选是一项重要的、长期而繁重的工作。自然界存在着各种各样的微生物，尤其是土壤中微生物种类齐全，是微生物的大本营。因此可以从土壤中分离到几乎所有微生物。另外，不同的自然界环境中生存的微生物优势菌种也不同。各种食品、农副产品等营养组成不同，从中可以分离出不同的微生物。食品工业菌种常用的分离源有被污染的生产或科研菌种、生产中长期使用的菌种、发酵食品用菌种、动物肠道菌群、经各种育种方法处理过的微生物材料和自然界菌种样品。自然界的微生物是混杂生存的，要从中分理出一种微生物，不仅需要考虑分离源应含有较多数量的目的菌，还要在分离操作中使之与其他菌种相互分开。对于样品中含量较低的菌处，要针对其生物学特点合理设计分离方法，如富集培养、选择培养、利用其特殊的生理反应产生特定的生长现象等，以便于从大量杂菌中选出目的菌种。从混杂群体中分离特定微生物的常用方法有：控制分离培养基的营养成分、控制培养基的pH值、添加抑制剂、控制培养温度、控制空气条件、对样品进行特殊处理等。常用的纯种分离方法有平板划线分离法、简单平板分离法、稀释分离、涂布分离法、毛细管分离法、显微操作单细胞分离法等。本实验将采用稀释法和涂布法对目的微生物进行分离筛选。优良曲霉菌的分离采用透明圈法，即先用淀粉琼脂培养基培养样品，由于糖化酶的作用，长出的菌落周围的淀粉被水解，遇碘后呈无色透明圈而平板的其他处呈蓝色。一般来讲，透明圈的直径越大，该菌的糖化力越强。可根据透明圈的大小筛选出糖化力强的菌株。酸乳中乳酸菌的分离采用溴甲酚绿（BCG）牛乳营养琼脂平板分离法。溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中呈蓝色。在分离培养基（pH6.8）中加处溴酚绿指示剂后呈蓝绿色，乳酸菌在该培养基中生长并分解乳糖，产生乳酸，使菌落呈黄色，菌落周围的培养基也变为黄色。乳酸可用纸上层析法鉴别。3材料3.1样品黑曲霉种曲、酸奶。3.2器具及其他用品平皿、三角瓶、涂布器、试管、玻璃珠、纱布。3.3培养基及试剂2%淀粉察氏培养基、BCG牛乳培养基、0.02mol/L碘液、10%牛乳培养基、无菌生理盐水。4流程4.1优良糖化酶菌株的分离与筛选融化培养基→倒平板→打散孢子团粒→梯度稀释→涂布平板→培养观察→滴加碘液→挑菌落→接种→培养→糖化酶活力测定→菌种保存4.2酸乳制品中的乳酸菌的分离制培养基→倒平板→梯度稀释→涂布平板→培养观察→挑菌落→接牛乳管→培养观察→传代培养→挑选凝乳管→乳酸测定→菌种保存5步骤5.1优良糖化酶菌株的分离与筛选（1）融化淀粉察氏培养基，稍冷后倒平板与斜面数个。（2）取种曲少许，加入10mL带玻璃球的无菌生理盐水的三角瓶中，用力振荡打散孢子团粒，使之形成均匀的孢子悬浮粒。然后将其用无菌纱布过滤于无菌试管中。（3）将上述滤液以10倍稀释法知释至10-7，取后3个稀释度的稀释液各0.2mL，于淀粉察氏培养基平板上用无菌涂布器分别依次涂布2至3个皿，30℃培养1~2d。（5）性能测定：测定各菌落的糖化酶活力。5.2酸乳制品中的乳酸菌的分离（1）制备BCG牛乳营养琼脂培养基。①称取脱脂奶粉10g，溶于50mL水中，加入1.6%溴甲酚绿酒精溶液0.07mL，0.075MPa压力下灭菌20min。②另取琼脂2g，溶于50mL水中，加酵母膏1g，溶解后调pH值至6.8，0.1MPa压力下灭菌20min。③趁热将上述两液以无菌操作混合均匀，倒平板6个，待凝固后，置37℃培养24h，若无杂菌生长，即可使用。（2）将样品以10倍稀释法稀释至10-7，取其中10-7、10-62个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL，分别置于上述各营养平板上，用无菌涂布器依次涂布2至3个皿，置43℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基亦为黄色者初步定为乳酸菌。（3）将典型菌落转至脱脂乳发酵管，43℃培养8~24h，若牛乳管凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色呈阳性，则将其连续传代若干次，43℃培养，挑选出在3~4h能凝固的乳管，保存备用。（4）乳酸菌的鉴定及生物量的测定。6结果（1）描述黑曲霉分离株的形态特征及其分生孢子头的生态。（2）绘制所分离的乳酸菌形态图，并记录结果。7思考题（1）为什么溶解样品的瓶内要加入玻璃珠？（2）说明用透明圈直径与菌株淀粉酶产量有何关系？（3）哪些情况能够引起凝乳？