基因诊断与基因治疗.

基因诊断与基因治疗刘在贵基因变异疾病类型1、内源基因的变异，有两种情况①基因结构突变点突变、缺失或插入突变、染色体易位、基因重排、基因扩增突变发生在生殖细胞则引起遗传性疾病突变发生在体细胞则导致等肿瘤和心血管疾病②基因表达异常2、外源基因的入侵各种病原体入侵人体后，其特异性基因被带入人体并增殖引起各种疾病。第一节基因诊断一、基因诊断的概念、特点和意义基因诊断是以探测基因的存在、分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而达到诊断疾病的一种方法。又称DNA诊断或DNA探针技术或基因探针技术。基因诊断的特点：(1)针对性强、特异性高；(2)取材用量少，而来源广，灵敏度高；血液、尿液和羊水脱落细胞及头发等都可以用于检测。由于基因体外扩增技术的发展，标本只需微量，目的基因只需pg水平。(3)适应性强，检测范围广。基因探针的来源种类较广，检测目的可为一个特定基因，亦可为一种特定的基因组，可为内源基因亦可为外源基因。据调查数据，截至2006年4月1日，中国各类残疾人总数达8296万人，残疾人占全国总人口的比例为6.34％。其中相当数量的是先天畸形和遗传性疾病。开展这些疾病的产前诊断，杜绝患儿出生，降低发病率，具有重大意义。二、基因诊断的途径、技术和方法（一）基因诊断的途径基因诊断的途径主要有三种：基因突变的检测基因连锁分析mRNA的探测１、基因突变的检测致病基因的某些突变类型与发病具有直接的因果关系，检测这种基因突变作为诊断依据是最理想的途径。２、基因连锁分析由于致病基因可在任何位点上产生突变，致使同一种疾病有不同的突变类型。可采用基因连锁分析。同一条染色体上相邻近的基因一起被遗传称为基因连锁，可以作为遗传标志。连锁分析主要是应用DNA限制酶片段长度多态性（RFLP）位点的不断发现和定位。３、mRNA的检测从基因水平上提供基因功能是否正常的直接证据。（二）基因诊断的常用技术方法核酸分子杂交技术限制性内切酶谱分析法DNA限制性长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP)分析等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO)杂交法聚合酶链反应(PCR)基因测序基因芯片核酸分子杂交技术1、限制性内切酶谱分析法2、DNA限制性长度多态性分析3、等位基因特异寡核苷酸探针杂交法（ASO杂交法）限制性内切酶酶谱分析此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片断的状态（片断的大小和数量）在电泳迁移率上也会随之改变，借此可以做出分析诊断。典型例子：镰状红细胞贫血的诊断DNA限制性片段长度多态性分析在人类基因组中，平均200对碱基可发生一对变异称为中性突变。中性突变导致个体间核苷酸序列的差异称为DNA多态性。DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶切后产生长度不同的DNA片断，称为限制性片段长度多态性。由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现。RFLP分析RFLP按孟德尔方式遗传：在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可以利用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断家族成员或胎儿是否为致病基因的携带者。RFLP可用Southern印迹杂交法检出。用Southern杂交检出RFLP时，如探针跨越切点，则被切开的两个片段均可与探针杂交，从而显示两条杂交带。诊断原理及应用甲型血友病、囊性纤维病变、苯丙酮尿症等可以利用这一方法得到诊断ASO杂交法原理遗传病的遗传基础是基因顺序发生突变。根据已知基因突变位点的核苷酸序列人工合成2种寡核苷酸探针：寡核苷酸探针M：相应于突变基因碱基序列寡核苷酸探针N：相应于正常基因碱基序列利用两种探针分别与受检者DNA进行分子杂交，分析杂交结果，既可以确定已知突变的存在与否，还可以发现新的基因突变。聚合酶链反应(PCR)此技术可以扩增目的DNA片段。既解决了其它方法样品需求量大的问题，还极大地提高了灵敏度。目前主要是PCR方法和其它方法的联合应用，例如：PCR/ASO法PCR/SSCP（单链构象多态性分析）法PCR/RFLP法PCR/限制酶谱法等具体原理略PCR/SSCPPCR/单链构象多态性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)正常人纯合突变杂合突变Leber病患者PCR/SSCP分析+﹣PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。基因测序分离出患者有关基因，测定出其基因的碱基序列，找出变异所在。这是最为确切的基因诊断法。由于技术原因，目前在临床应用上有困难。核酸序列分析前已述。RNA诊断以DNA为检测对象，探测DNA序列中的突变情况可以称为DNA诊断。以mRNA为检测对象的诊断方法称为RNA诊断。RNA诊断通过对待测基因的转录产物进行定性、定量分析，可以确定其剪接、加工的缺陷及外显子的变异。常用的RNA诊断方法有RNA点杂交、Northern分析和定量逆转录PCR等。基因芯片指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测得标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要信息的一种技术。基因芯片的其它名称基因芯片（genechip）又称为DNA芯片（DNAchip）DNA阵列（DNAarrays）寡核苷酸微芯片（oligonuncleotidemicro-chip）。基因芯片的应用：核酸序列分析基因表达分析寻找新基因突变体和多态性检测药物筛选药物作用机制研究毒理学研究基因扫描环境化学毒物的筛选耐药菌株和药敏检测等。三、基因诊断的应用遗传疾病肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定（一）遗传疾病的基因诊断由于基因发生突变或畸变所引起的一些可以传给子代的疾病称为遗传病。由基因组某单个基因座上存在疾病基因所引起的遗传病称为单基因遗传病。由多个基因座存在有致病基因，并共同作用，有时还需要一定的环境因素参与才导致个体发病，这类疾病称为多基因遗传病。诊断方法：(1)致病基因已经完全了解或部分了解，分子病理学完全清楚或部分清楚，可应用限制酶图谱法或寡核苷酸探针直接分析基因内的缺陷；(2)已经知道致病基因及其部分结构，获得了基因探针，但对分子病理学了解较少或不了解，或者是过于复杂，可以应用基因探针进行RFLP的连锁分析；(3)对致病基因尚一无所知或知道的很少，则主要是依靠基因外与其紧密连锁的RFLP进行间接分析。１、点杂交法诊断α-地中海贫血地中海贫血是世界上最常见和发生率最高的一种单基因遗传病。地贫分为两类：α-地贫：α-链缺失，出现β４β-地贫：β-链缺失，出现α４方法是将患者白细胞DNA或产妇的羊水细胞DNA用α-链的基因探针进行点杂交。以正常人为对照，观察放射自显影的强度，可初步诊断α地贫。２、采用Southern印迹法进行产前诊断３、限制性酶谱分析法诊断镰刀状细胞贫血４、苯丙酮酸尿症的限制性片段长度多态性（RFLP）分析（二）恶性肿瘤的基因诊断肿瘤的发生和发展与癌基因和抑癌基因密切相关。基因分析表明恶性肿瘤有两种类型的变化：(1)肿瘤细胞甚至癌前细胞中某些基因发生了结构或位置上的改变，导致基因表达产物在质、量和表型上的变异，常有某种明显的标志。(2)肿瘤细胞与正常细胞相比，结构基因并无差异，但在表达水平和调控水平上发生了改变。肿瘤的基因分析可根据不同的目的进行基因结构或基因表达的基因分析。肿瘤基因分析的应用：(1)直接用于肿瘤的诊断，特别是早期诊断；(2)对癌症进行更准确的分类、分期和预后估计；(3)更精确地鉴别癌前病变；(4)对癌进行定位、大小和扩散的检测；(5)对癌易感者和具有癌遗传倾向的个体进行监测；(6)发现特异基因产物并用于制订特殊治疗方法和方案等。人类肿瘤中，进行基因诊断最成功的例子是淋巴样肿瘤。运用淋巴细胞抗原受体基因发生重排进行基因诊断。基因重排和易位会使在恒定区基因两侧的某些限制酶切位点发生改变限制酶切位点消失或产生引起水解片段长度的改变以恒定区片段或连接区片段为探针，进行Southern杂交确定基因重排的存在与否B淋巴细胞的恶性肿瘤存在Ig重链和轻链的克隆化基因重排现象。见P282。（三）病原体的基因诊断人类免疫缺陷病毒（HIV）的基因诊断以原位核酸杂交（ISH）和PCR技术应用较广。感染性疾病采用DNA诊断的基本前提：(1)病原体基因组DNA具有特异的序列；(2)能将此特异DNA序列制备成特定的探针。例：ISH检测HIV：先将细胞样品进行脱水消化用核酸酶处理再用多聚甲醛固定后加热变性与35S-HIV-DNA杂交自显影镜下观察细胞内HIV核酸的自显影颗粒自显影颗粒比背景高5倍以上，可确定细胞为HIV阳性。诊断由疟原虫感染所致恶性疟疾：不同种疟原虫DNA结构各异但它们基因组DNA都含有一定的重复序列其重复序列的结构和重复数目互不相同根据重复序列制备成32P标记探针与疟原虫感染血进行分子杂交敏感度可达0.001%目前，国内外已在几十种感染性疾病中开展了基因诊断。（四）多基因病的基因诊断与单基因病相比较，多基因病涉及基因数量多，情况更复杂，如高血压、冠心病和精神性疾病等。多基因病的基因诊断要搞清参与发病的致病基因在染色体上的位置。近年来采用RFLP连锁分析已对这些疾病进行了研究。（五）基因诊断的其它应用基因诊断技术还在其它许多方面发挥着作用。如：斑点杂交法对人性别的测定，DNA指纹图进行亲子鉴定，法医学鉴定等。第二节基因治疗GeneTherapy一、基因治疗的概念、类型和意义（一）基因治疗的概念基因治疗是向靶细胞引入外源基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗目的。基因治疗的概念早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。（二）基因治疗的类型１、按基因治疗的对象分为三类(1)体细胞基因治疗：(2)生殖细胞基因治疗：(3)对外来侵入病原基因组进行基因治疗(1)体细胞基因治疗：将正常基因导入基因缺陷患者的特定组织细胞中，以纠正这一细胞的遗传缺陷，从而使疾病得以治疗。体细胞疗法不影响后代，是当前基因治疗的主要类型。(2)生殖细胞基因治疗：针对发生基因突变的生殖细胞基因组进行改造。通过显微注射进入受精卵的外源基因，到达发育后成熟的生殖细胞，遗传到下一代。不仅可以纠正某一品系的遗传缺陷，而且还可以改良动物品种。生殖细胞基因治疗技术尚不能在人类进行。(3)对外来侵入病原基因组进行基因治疗主要指传染病病原体的治疗。２、基因转移方法分为三类(1)物理化学法：DNA与磷酸钙共沉淀、显微注射、电穿孔、脂质体包埋和染色体介导微细胞融合等。(2)病毒载体法：重组病毒作载体，构建携带目的基因的重组病毒，去感染细胞。(3)基因打靶技术：设计与疾病基因有同源序列的打靶载体，利用同源序列重组原理，把目的基因定点整合在突变位置上。３、基因转移后所起的作用可分为四类：(1)基因表达(2)基因置换(3)基因添加(4)基因抑制基因治疗的基本方法（一）基因矫正(genecorrection)将致病基因的异常碱基进行纠正，保留正常部分。（二）基因置换(genereplacement)用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。（三）基因增补基因增补(geneaugmentation)–指的是将目的基因导入病变细胞或其它组织，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整