荧光原位杂交实验-FISH

荧光原位杂交实验FluorescenceInSituHybridization原位杂交(Insituhybridization)1）同位素原位杂交(Isotopicinsituhybridization)——70年代2）非同位素原位杂交(Non-isotopicinsituhybridization)——80年代中后期（1）免疫酶联（2）荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH)**同位素原位杂交的不足之处：1）不稳定；2）高背景；3）曝光时间长；4）结果统计学处理繁琐。5）同位素的使用和处理实验的基本原理:FISHisthedetectionofhighlyspecificDNAprobeswhichhavebeenhybridizedtoeitherinterphaseormetaphasechromosomesusingfluorescencemicroscopy.DNAforprobeuseislabeledwithfluorescent(directmethod)ornonfluorescentmoleculeswhicharethendetectedbyfluorescentantibodies(indirectmethod).Theprobesbindtoaspecificregionorregionsonthetargetchromosome.Thechromosomesarethenstainedusingacontrastingcolor,andthecellsareviewedusingafluorescencemicroscope.**荧光原位杂交的特点：1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色。**FISH有上述优点的原因：使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统标记探针的物质：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin)——半抗原报告分子（间接标记）（2）荧光物质（直接标记）FLUORESCENTlabeleddUTPHAPTENElabeleddUTPAMCA-6-dUTPCascadeBlue-4-dUTPFluorescein-12-dUTPRhodamine-6-dUTPTexasRed-6-dUTPCy3-6-dUTPCy5-dUTPBiotin(BIO)-11-dUTPDigoxygenin(DIG)-11-dUTPDinitrophenyl(DNP)-11-dUTP染色体复染的物质:PropidiumIodide(PI)（红色）DAPI（兰色）quinacrine（绿色）chromomycineA3（绿色）染色体“原位抑制”杂交（chromosomeinsitusuppression,CISS)克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针中加入过量的未标记的竞争性DNA(competitorDNA)，如humanCot-1DNA，进行杂交前的预复性。探针中的重复序列与加入的竞争物中的大量重复序列优先复性，而特异性的单拷贝序列因竞争物中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。**FISH技术的应用1）基因（或DNA片段）的染色体定位；2）染色体数目与结构异常的检测；3）间期细胞遗传学（绒毛/羊水/精子/卵裂球/其它间期细胞研究与诊断）；4）肿瘤遗传学研究**用于FISH的探针1）单拷贝探针：（1）种类：YAC，BAC，Cosmid，Plasmid，cDNA片段（2）应用（a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证；（b）确定染色体微小缺失与重复；（c）染色体断裂点分析。（d）间期细胞染色体数目异常诊断。DNA片段的染色体定位FISH检测微小缺失染色体片段重复Dup19(p13.2-13.121q22.2BAC克隆在Down综合征间期细胞中的杂交信号２）简单重复序列探针(simplerepetitiveprobes)——异染色质着丝粒探针(heterochromaticcentromerprobes)其靶序列为α卫星DNA或卫星IIIDNA(alphasatellite/satelliteIIIDNA)多位于染色体的着丝粒和异染色质区域，重复数百次至数千次。特点：信号强应用：(a)标记染色体识别(b)染色体数目异常检测(c)间期细胞遗传学研究和临床诊断**间期细胞遗传学的意义：细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一，经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相，间期FISH为这一时期遗期传物质的研究提供了可能，而且快速。３）染色体涂染探针(chromosomepaintingprobes)整条染色体探针或染色体区带特异性探针探针来源：（1）含有人单条染色体的人-啮齿类(human-rodent)体细胞杂种组织融合的产物；（2）荧光激活的流式细胞仪(fluorescence-activatedcellsorter,FACS)分离整条染色体DNA，并以载体克隆/PCR扩增；（3）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增；应用（1）染色体数目和结构异常分析；（2）不同物种间的同源性比较；（3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。多色FISH（muti-colorFISH)多色复合染色体FISH探针(multiplexFISH,M-FISHprobes)#两种以上不同的非同位素标记，不同的荧光检测系统，通过不同的滤光片组合或极少数几种非同位素标记探针后，按照不同的比例混合，可以显示多种颜色。实验的基本操作步骤及时间安排一淋巴细胞的培养及染色体标本制备第一天（星期一）采血、接种（10:00）第二天（星期二）培养第三天（星期三）培养第四天（星期四）上午7:00加秋水仙素,(终浓度0.2ug/ml）至上午10:00结束培养制片，不染色，在显微镜下挑选分散良好的标本。将选好的标本放入50℃烤片。第五天（星期五）探针变性：75℃水浴5分钟，立即置于0℃（冰浴中）5-10分钟。玻片标本变性：1.50℃温箱中2小时2.标本在70-75℃，70%甲酰胺/2XSSC中变性2-3分钟。3.立即脱水，70-90-100%顺序，各5分钟。4.室温干燥原位杂交：将变性的DNA探针10ul滴于变性并脱水的玻片标本上，盖上盖玻片，Parafilm封片，置于湿盒中37℃杂交过夜。（15-17hr）第五天实验结束(第六天，星期六)洗脱、信号放大和免疫荧光检测1.用刀片将盖片揭起，轻轻移掉。2.45℃50%甲酰胺/2XSSC中洗3次，每次5分钟。3.45℃1XSSC中洗3次，每次5分钟。4.室温下，2XSSC轻洗一下。5加180ul封闭液I，以薄膜盖片，37℃温育20分钟，加入180ulavidin-FITC,37℃温育45分钟。6.取出标本，45℃，4XSSC/0.1%Tween20中洗3次，每次5分钟。7加封闭液II,37℃温育20分钟。8加180ulantiavidin于标本上，37℃45分钟。9取出标本，45℃，4XSSC/0.1%Tween20中洗3次，每次5分钟。10加180ul封闭液I，37℃温育20分钟。11加180ulavidin-FITC，37℃温育45分钟。12取出标本，45℃，4XSSC/0.1%Tween20中洗2次，每次5分钟。再于2XSSC室温轻洗一下。13将玻片自然干燥，PI/antifade复染，盖上盖片。14镜检、照相。