第10章--化学发光免疫试验

第一章血液标本采集与处理临床免疫学检验技术第十章化学发光免疫试验张国军目录第一节概述第二节化学发光剂的特征第三节化学发光免疫试验的类型第四节化学发光免疫试验的临床应用第五节临床常用化学发光免疫试验试剂方法特点第六节影响化学发光免疫试验的主要因素第一节概述重点提示发光化学发光化学发光的条件化学发光的效率化学发光免疫试验的分类化学发光免疫试验的非均相分离方式一、发光的分类发光：是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、化学发光。光照发光是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，跃迁到激发态，当其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。生物发光是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象，由于化学反应产生电子能级处于激发态的物质，后者通过跃迁释放能量产生光子，从而导致的发光现象。二、化学发光产生的条件一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下：A+B→C*C*→C+hγ若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：A+B→C*C*+D→C+D*D*→D+hγ无论直接化学发光还是间接发光，一个化学反应要产生发光现象，必须满足以下条件:1.该反应必须提供足够的激发能，并由某一步骤单独提供，因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光。2.要有有利的反应过程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。3.激发态分子必须具有一定的化学发光效率释放出光子，或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子。三、化学发光效率化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（φCE）和激发态分子的发射效率（φEM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。四、化学发光免疫试验的分类化学发光免疫分析，根据待测分子的大小可设计成多种反应模式，如夹心法、竞争法等。根据游离标志物和结合标志物是否需要分离，可分为均相和非均相测定两种。根据化学发光试验中标志物的不同及反应原理的不同，大体可分为四种类型：直接化学发光免疫试验、化学发光酶免疫试验、电化学发光免疫试验、发光氧通道免疫试验。五、化学发光免疫试验的非均相分离方式为实现游离标记物和免疫复合物标记物的分离，各系统采用的方法各有不同，主要采用固相、过滤、珠式、顺磁性颗粒分离等方式第二节化学发光剂的特性重点提示直接化学发光剂电化学发光剂酶促反应发光剂在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体，常用的为吖啶酯。三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。酶促反应发光剂是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。常用的有鲁米诺及其衍生物和AMPPD。化学发光剂的发光原理详见第四章。第三节化学发光免疫试验的类型重点提示直接化学发光免疫试验电化学发光免疫试验发光氧通道免疫试验一、直接化学发光免疫试验原理：用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。直接化学发光的原理-双抗体夹心法二、电化学发光免疫试验原理：磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)，用三联吡啶钌标记抗体(抗原)，待测标本与相应的抗原(抗体)发生免疫反应，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。电化学发光的原理-双抗体夹心法三、发光氧通道免疫试验LOCI技术基于抗原抗体反应，此检测体系中用了三种试剂：1.感光微粒感光微粒是覆盖有亲和素和酞菁染料的乳胶聚苯乙烯微粒，可以吸收680nm的光，生成高能单线态氧。2.发光微粒发光微粒含有烯烃染料和特异性抗体（抗原），可以与单线态氧反应，放出612nm光信号。复合物释放的化学光在612nm被LOCI检测器读取。只有两种粒子形成二聚体才能生成化学光信号。3.生物素化抗体特异的抗体与生物素结合后，形成生物素化抗体，可以与含有亲和素的感光微粒结合。发光微粒与感光微粒结构示意图LOCI技术的原理是高能单线态氧的产生和传递。在受到红色激光（680nm）照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为高能单线态氧，高能单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了离子氧的传播直径很小（约为200nm）。如果发光微粒在200nm范围之内就能接受离子氧，并发出高能级的光（610nm）。相反，如果在200nm直径范围内没有发光微粒，高能态离子氧就会回落到基态氧而没有信号产生。在LOCI系统中，包被有特异性抗体的发光微粒、生物素化的特异性抗体与待测物结合形成发光微粒-待测物-生物素化抗体复合物，该复合物可以与含有亲和素的感光微粒结合，从而拉近了感光微粒与发光微粒的距离，使得距离200nm。当680nm的光照射时，感光微粒使周围环境中的氧转化为高能单线态氧，高能单线态氧被发光微粒捕获，与化学微粒发生反应，释放出612nm光信号，被检测器读取。发光氧通道免疫试验原理四种化学发光试验的比较直接化学发光酶促化学发光电化学发光发光氧通道化学发光剂吖啶酯ALP/HRP三联吡啶钌感光微粒免疫反应模式夹心法、竞争法夹心法、竞争法夹心法、竞争法夹心法、竞争法光信号闪光辉光电激发闪光激发光反应速度快速较快速快速快速影响结果的因素少较多少少发光底物NaOH-H2O2金刚烷、鲁米诺电激发发光微粒检测成本高低高低均相/非均相反应非均相非均相非均相均相第四节化学发光免疫试验的临床应用由于化学发光免疫试验技术具有无放射性污染、可自动化、高灵敏度、高准确度、高特异性的特点，因此已广泛应用于各种激素、肿瘤标志物、治疗性药物浓度监测、传染性疾病的筛查、出生缺陷的产前诊断、细胞因子等的临床测定。第五节临床常用化学发光免疫试验试剂方法特点重点提示直接化学发光试剂特点电化学发光试剂特点发光氧通道试剂特点一、直接化学发光试剂该类分析试剂通常采用磁颗粒包被抗原或抗体，增加反应的表面积，提高反应的灵敏度，缩短反应的时间。应用磁力吸附分离，冲洗彻底，提高反应的特异性。有的化学发光免疫分析试剂还采用专利技术的吖啶酯类（N-磺酰基）羧基氨基化合物作为标记物，在非竞争免疫分析模式中有极好的测试灵敏度和极宽的线性范围。背景噪音极大降低，从而检测灵敏度大大提高；同时，该复合物还有极好的稳定性，有更长的试剂效期和全面的、极好的试剂表现。二、电化学发光试剂电化学发光试剂采用独特的磁性微粒子固相载体技术、专利的链霉亲合素－生物素间接包被技术以及独到的信号检测系统，使得检测反应速度快、灵敏度高、线性范围宽。三、发光氧通道免疫试验试剂发光氧通道免疫试验试剂主要由感光微粒、发光微粒和生物素化的抗体三部分组成。感光微粒与发光微粒均匀分布在反应体系中，在分子作用力下自由运动，能更快速、充分的完成免疫反应，所以光激化学发光的免疫反应时间更短。由于反应原理的特殊性，整个反应过程稳定，不易受到pH值、离子强度和温度的影响，同时检测的灵敏度更高。四、酶促化学发光试剂详见第九章第六节影响化学发光免疫试验的主要因素重点提示标本的影响试剂的影响其它影响一、标本的影响新鲜标本的检测结果更能准确反映机体的真实情况，应在采血后24小时内完成检测；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，易造成假阳性结果；标本反复冻融，也容易造成假阳性。若待测抗原浓度过高，易出现“钩状效应”，使结果偏低，应对标本进行适当稀释。二、试剂的影响化学发光免疫检测试剂厂家较多，不同厂家生产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。试剂应按照说明书要求保存，不同批号试剂盒中组分不能混用，混用造成重复性差。三、其它影响某些因素对发光或荧光存在干扰，如温度的波动会影响发光反应和荧光效率；直接化学发光可因反应体系的PH值改变产生的影响；金属离子（如Mg2+）也会严重干扰发光反应和荧光效率。同时，标本中常用的防腐剂和抗凝剂也会干扰免疫反映，或者通过抑制酶活性以及发光或荧光效率干扰结果的稳定性。本章小结直接化学发光免疫试验的原理及特点电化学发光免疫试验的原理及特点发光氧通道免疫试验的原理及特点