透明质酸酶的研究进展

·综述与专论·2014年第3期生物技术通报BIOTECHNOLOGYBULLETIN透明质酸酶（Hyaluronidase，HAase）是广泛分布于自然界中的一类糖苷酶，通过作用于β-1，3或β-1，4糖苷键来降解透明质酸（Hyaluronicacid，HA）（图1）。此外，还可在一定程度上催化作用于软骨素（Chondroitin，CS）和硫酸软骨素。透明质酸酶首次发现于1929年，Duran-Reynals［1］在哺乳动物睾丸及其他组织提取物中发现一种可促进疫苗、染料、毒素等扩散的“扩散因子”，随后被鉴定为透收稿日期：2013-07-01作者简介：苏康，女，硕士，研究方向：微生物与生化药；E-mail：[e-mail]通讯作者：吉爱国，男，博士，教授，研究方向：微生物与生化药；E-mail：[e-mail]透明质酸酶的研究进展苏康 吉爱国（山东大学威海分校国际生物技术研发中心山东大学威海分校海洋学院，威海264209）摘要：透明质酸酶是以降解透明质酸为主的糖苷酶。近年来国内外关于透明质酸酶各方面的研究日益增多，透明质酸酶的构效关系及生物学应用越来越引起人们的关注。对透明质酸酶的相关研究进行了综述，主要阐述了各类型透明质酸酶的研究概况包括人透明质酸酶、牛睾丸透明质酸酶、毒液透明质酸酶、微生物透明质酸酶。简要介绍了透明质酸酶的活性测定、酶活抑制剂及透明质酸酶制剂的应用情况，最后对透明质酸酶的研究前景进行展望。关键词：透明质酸酶哺乳动物毒液微生物抑制剂ResearchofHyaluronidasesandFutureDevelopmentSuKangJiAiguo（InternationalBiotechnologyResearchCenter，ShandongUniversityatWeihai，MarineCollege，ShandongUniversityatWeihai，Weihai264209）Abstract: Hyaluronidaseisakindofglycosidasewhichmainlydegradehyaluronicacid.Researchonhyaluronidase-anegeletedenzymeforalongtimeincreasedinrecentyears.wemainlyreviewedthecurrentresearchontheseveralresourcesofhyaluronidase,includinghumanhyaluronidase,bovinetesticularhyaluronidase,animalvenomhyaluronidaseandbactericalhyaluronidase.Moreover,theenzymeactivityassaysandclinicalapplicationwerereviewed.Finallythefutureresearchonhyaluronidasewasprospected.Key words: HyaluronidaseMammalVenomMicroorganismInhibitor明质酸酶。由于透明质酸酶分离纯化困难且似乎没有研究意义，长期被忽略。近年来透明质酸酶的研究成为一个热点，研究者们试图探究其性质及在生物学过程中的应用。1各类透明质酸酶研究概况透明质酸酶是使透明质酸产生低分子化作用酶的总称。目前来说透明质酸酶有3种分类方法，分别依据最适反应pH值、氨基酸序列同源性及来源、OOHCOOHOHO*OCH2OHNHCOCH3HOOOOCOOHOHOHOCH2OHNHCOCH3OHOO*图1透明质酸结构生物技术通报BiotechnologyBulletin2014年第3期16结构和作用机制划分。最为经典的是1971年Meyer根据透明质酸的来源、结构和作用机制的不同将透明质酸酶分为3类（表1）。以下分别简单阐述哺乳动物来源、动物毒液及微生物来源的透明质酸酶。表1透明质酸酶分类分类来源作用底物作用机制终产物内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（EC3.2.1.35）脊椎动物及动物毒液软骨素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、HA水解酶，转糖甘酶，作用于β-1，4糖苷键四糖内切-β-葡萄糖醛酸苷酶（EC3.2.1.36）水蛭唾液腺和十二指肠虫特异性降解HA水解酶，作用于β-1，3糖苷键四糖或己糖（还原端为葡萄糖醛酸）透明质酸裂解酶（EC4.2.2.1）细菌如：梭菌属、微球菌、链球菌、链霉菌透明质酸、软骨素、硫酸软骨素作用于β-1，4糖苷键，β-消去机制2-（乙酰基氨基）-2-脱氧-D-葡萄糖为主产物1.1哺乳动物透明质酸酶人类基因组包含6种透明质酸酶，相似性在33%-42%之间［2］。其中HYAL-1（HYAL，GeneofHyaluronoglucosaminidase）、HYAL-2、HYAL-3三种基因位于3p21.3染色体，另外3种基因HYAL-4、HYAL-P1和PH-20/SPAM1位于染色体7q31.3［3］。目前关于人透明质酸酶的研究主要集中在Hyal-1、Hyal-2及PH-20。Hyal-1在哺乳动物肝、肾、脾及心脏中含量较高，集中分布于溶酶体中［4］。Hyal-1是57kD的酸性糖蛋白，能催化降解各种分子量的HA产生以四糖/己糖为主的产物。Hyal-2分布于溶酶体中或通过糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinosi，GPI）锚定在血细胞膜上，调节胞内及胞外透明质酸的分解代谢，最适pH为4。Hyal-2有特定的底物特异性，可将HA分解至20kD大小（约50-60个双糖单位）的片段［5］。哺乳动物体内Hyal-1和Hyal-2分工明确，首先由细胞表面的Hyal-2将HA降解至约20kD的片段，随后由Hyal-1催化糖片段为四糖［6］。Hyal-2作为一种功能性受体与多种病毒如绵羊进行性肺炎病毒、山羊地方性鼻内肿瘤病毒的膜蛋白结合，介导病毒进入人体。PH-20蛋白（Spermadhesionmolecular1，SPAM1）是锚定于膜的多功能蛋白，存在于睾丸、附睾、雌性生殖道、胸、肠及恶性肿瘤中。PH-20是一种多功能蛋白，除透明质酸酶活性外还有其他功能。不同于人类，家鼠基因组中有7种编码透明质酸酶的基因。HYAL-1、HYAL-2、HYAL-3位于染色体9F1-F2，HYAL-4、PH-20/SPAM1、HYALp1位于染色体6A2，第7种透明质酸酶HYAL-5位于与6A2相近的基因簇［7，8］。其中Hyal-5和Hyal-p1与其他类型的透明质酸酶具有较高的序列相似性。Hyal-5在不同pH值下稳定性较高［8］。除家鼠外，Hyal-5也存在于其他啮齿类动物中。家鼠的受精作用成功与否主要取决于Hyal-5，PH-20基因缺失的精子只要Hyal-5正常表达便能成功受精。鼠源HYAL-1与人源HYAL-1具有73%的相似性［9］。相对于HYAL-1，HYAL-2更加重要，鼠胚胎中HYAL-2的突变具有致命性。目前，市售透明质酸酶多数从哺乳动物睾丸组织提取的，其中主要是牛睾丸透明质酸酶（Bobvintesticularhyaluronidase，BTH）。BTH是一种内切糖苷酶，作用于β-1，4糖苷键来降解透明质酸。除透明质酸，BTH也能够降解软骨素、硫酸皮肤素、4-硫酸软骨素及6-硫酸软骨素。质谱分析测得终产物中主要成分为四糖，饱和多糖为最少的分解产物［10］。BTH是糖苷水解酶56家族中唯一建立3D结构的酶［11］。1.2动物毒液透明质酸酶透明质酸酶存在于许多动物毒液中，目前在蜜蜂、蛇、蜘蛛、玫瑰毒鲉、蜥蜴及蝎子毛虫的毒液中检测到了透明质酸酶的活性。透明质酸酶降解血管周围基质中的透明质酸使毒素易于进入血管，是毒液从受伤部位进入体循环的关键。从等电点看，动物毒液中的透明质酸酶均为碱性蛋白，约33-110kD。目前从蜘蛛毒液中分别提取得到33、44、45和64kD的透明质酸酶［12］。众多毒液来源的透明质酸酶中关于蜜蜂毒液透明质酸酶（Beevenomhyaluronidase，BVH）的研究2014年第3期17苏康等：透明质酸酶的研究进展较早且较为深入，究其缘由是因为蜜蜂毒液中透明质酸酶的含量相对较高。BVH是首个经cDNA克隆于大肠杆菌表达所得的真核生物来源的透明质酸酶，是一种透明质酸4-糖苷裂解酶（E.C.3.2.1.35），归属于糖苷裂解酶56家族，作用终产物为四糖［13］。该酶是由349个氨基酸组成的40.746kD的糖蛋白，糖含量在7%，蛋白结构中有4个半胱氨酸构成的二硫键和3个糖基化位点［14］。Markovic-Housley等［15］将BVH与HA四聚体合成结晶，晶体分析显示蛋白进行（β/α）7折叠而非常规的（β/α）8折叠，酶与HA结合位点位于保守氨基酸丰富的C末端，催化过程中谷氨酸为质子给予体，HA结构中的羧基基团为亲核体。除蜜蜂外，来自于虎头蜂、黄蜂等其他蜂类的透明质酸酶也有所研究。虎头蜂毒液中的透明质酸酶经cDNA克隆序列测定：含331个氨基酸，与BVH有56%的序列相似性［16］。SDS-PAGE以及质谱分析鉴定到黄蜂P.paulista毒液中有4种不同分子结构的透明质酸酶，通过蛋白质组学分析已将其中含量最高的HyalIII进行测序，建构3D结构。HyalIII含有288个氨基酸，分子量在44.340，pI9.50［17］从毒鲉科石鱼中提取得到的透明质酸酶SFHYAL是第一个被发现的海生生物来源的透明质酸酶。该酶62kD，pI9.2，本身无毒，是一种N-乙酰氨基-β内切己糖甘酶，作用β-1，4糖苷键，四糖为其终产物［18］。透明质酸酶普遍存在于所有蛇毒中，出于其危险性直至2004年才有所探究。经凝胶层析和离子交换层析从印度眼镜蛇（Najanaja）中可提取得到两种亚型的透明质酸酶：NNH1和NNH2。NNH1分子量70.406kD，pI在9.2。NNH1和NNH2属于中性蛋白在pH5-7有较高活力，对HA有底物特异性［19］。2012年从印度最危险的蛇角蝰中分离得到一种新型透明质酶CcHasell（33kD），最适pH5.5，最适温度37℃。钠离子能够提高该酶的活力，其他阳离子Ba2+、Ca2+、K+、Ni2+、Mn2+、Co2+、Cu2+和Hg2+对酶的活性有不同程度的抑制作用［20］。蝎毒、蜜蜂毒液、虎头蜂毒液和胡蜂毒液中的透明质酸酶是使人体产生IgE介导的致命过敏反应的过敏原。毒液中透明质酸酶的结构分析具有重要的临床意义，为毒液螫入人体产生病理学反应提供治疗依据。1.3微生物透明质酸酶透明质酸裂解酶是微生物致病过程中的毒力因子，通常与宿主组织直接接触或使病菌逃过其防卫机制。透明质酸裂解酶降解宿主基质中的透明质酸，使得宿主易患气性坏疽、脑膜炎、滑膜炎、增生、肾炎、霉浆菌症、牙周疾病、乳腺炎、肺炎、败血症、梅毒及毒性休克综合症等病症［21-23］。宿主体内的高分子量透明质酸参与免疫调节且具有抗炎活性，而微生物产生的透明质酸裂解酶将其所含高分子量透明质酸裂解成寡聚透明质酸，成为诱导炎症反应的因子，在宿主体内为微生物的生长塑造环境。多种细菌、噬菌体、真菌可表达产生透明质酸裂解酶（表2，表3）。革兰氏阳性菌分泌的透明质酸酶在细菌致病过程中起重要的作用，目前所有革兰氏阳性菌分泌的透明质酸酶能够引发动物伤口感染。B族链球菌是产HAase革兰氏阳性菌中研究较为深入的，B族链球菌HAase非特异性降解一种黏多糖，通常能够作用于HA和CS，蛋白结构C末端为酶与底物的结合部位［24］。革兰氏阴性菌也可产透明质酸酶，但在细菌的致病过程中不起作用。相对于噬菌体来源的透明质酸酶，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌产生的酶分子量相对较大，大约在50-60kD［25］。通过用X-ray对原酶、酶与降解产物的结合物以及酶定位突变的研究，细菌HAase的降解机制已清楚：首先酶与HA进行随机的结合，通过β消除机制将HA裂解为两个片段（第一步分解），两片段中