蛋白质组学的研究进展及应用

《蛋白质工程》（课程论文）题目名称：蛋白质组学技术的研究进展及应用所在学院：生命科学与技术学院专业（班级）：生技131班学生姓名：梁健授课教师：韩晓菲蛋白质组学技术的研究进展及应用生技131班梁健13772025摘要：随着人类基因组计划全部测序的初步完成，研究重点转到对基因功能的研究上。蛋白质作为基因功能的主要体现者，对其表达模式和功能的研究成为热点，出现了蛋白质组学。研究蛋白质组学有助于了解蛋白的结构、细胞的功能、生命的本质及活动规律，为疾病的诊断、治疗、疫苗及新药开发提供科学依据。关键词：蛋白质组学；进展；应用蛋白质组学(proteomics)是产生于20世纪90年代中期的一门新兴学科，以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象，是后基因组时代生命科学研究的核心内容。蛋白质组学的产生与发展经历了一个漫长的过程，在这个过程中，研究者不断修正蛋白质组学的发展方向和推进蛋白质组学相关支撑技术的快速发展，进而拓展蛋白质组学在整个生命科学和生物医学研究中的应用，成为后基因组时代重要的研究新领域，并成功地应用到基础研究及医学研究等各个领域，推进其迅速发展。1蛋白质组学的概念及研究内容1.1蛋白质组学的概念蛋白质组(proteome)源于protein和genome两词的杂合，最早是由澳大利亚的WILKINS等于1995年提出，其定义为“一种基因组所表达的全部蛋白质”。早期相对狭义的蛋白质组的概念是指在某一特定的时间和空间条件下，1个细胞的基因组所表达的蛋白质数目的总和。随着研究的深入，人们提出了广义的蛋白质组的概念，用来描述1个细胞、组织、器官或1个物种的生命个体，在其不同的生存及发育条件下所表达的各种蛋白数目的总和。所以蛋白质组所含的蛋白数目及其表达量是随着时间和空间的不同而不断发生变化的。蛋白质组学最有价值的优势是它可以观察在特定的时间下一个完整的蛋白质组或蛋白亚型在某种生理或病理状态中，发生的相应的变化。1.2研究内容根据研究内容的不同，蛋白质组学可分为差异蛋白质组学(或称表达蛋白质组学)、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学，其中差异蛋白质组学在蛋白质组学研究中十分常用且应用广泛。差异蛋白质组学主要是研究比较在2种或多种不同条件下蛋白质组表达的差异变化。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容，主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能和蛋白质间的相互作用。蛋白质的功能模式的研究是蛋白质组学研究的最终目标，目前主要集中于研究蛋白质相互作用和蛋白质结构与功能的关系，以及基因的结构与蛋白质的结构功能的关系。对蛋白质组成的分析鉴定是蛋白质组学中与基因组学相对应的主要部分，它要求对蛋白质进行表征即对所有蛋白质进行分离、鉴定及图谱化。蛋白质间的相互作用主要包括以下几类：分子和亚基的聚合；分子杂交；分子识别；分子自组装；多酶复合体。而分析一个蛋白质和已知功能的蛋白质相互作用是研究其功能的重要方法。2蛋白质组学的研究进展蛋白质组学研究的首要任务是建立获取和分析蛋白质的常规、可靠、有效的技术。为达到这一要求，就需要样品准备、数据获取标准化及自动化，也就是要有可重复的高通量的技术。蛋白质组研究的技术手段在不断完善，其工作流程是多步骤进行，包括蛋白质样本的制备、分离、定量及鉴定。由双向凝胶电泳、质谱技术、酵母双杂交系统、蛋白质微阵列技术、能进行大规模数据处理的计算机系统和软件、软电离技术及生物信息学技术等构成了蛋白质组学研究的主要技术体系。2.1双向聚丙烯酰胺凝胶电泳2D-PAGE是比较蛋白质组中蛋白表达量变化最常用的蛋白分离技术。传统的2D-PAGE最初是由O’Farrell、Klose及Scheele等于1975年分别建立起来的。此法可分离上千种蛋白，并可同时比较蛋白表达量的差异；可根据蛋白等电点(isoelectricpoint，pI)及分子质量的差别，有效地分离理化性质不同的蛋白，并可同时进行定性和定量分析；可区分磷酸化及非磷酸化蛋白或某些经过翻译后加工修饰的蛋白。2D-PAGE主要分为2步，第1步等点聚焦采用pH梯度胶根据蛋白等电点的不同进行电泳分离；第2步SDS—PAGE电泳则是根据蛋白分子质量的差异进行蛋白分离。2D-PAGE法的不足之处在于：仍主要依赖许多手工操作、费时、自动化程度不高；样品上样量有限，不易分析蛋白含量很低的临床样本；对某些高疏水性蛋白(如细胞膜蛋白)分离效果差；对表达量较低的蛋白(1000拷贝数)、极酸性(pI3)或极碱性(pI10)的蛋白检测均不理想；某些蛋白斑点中可能含有等电点和分子质量极为接近的数种蛋白，会给数据分析带来困难；还有一些蛋白由于分子质量太大(150ku)或太小(10ku）容易在分离过程中被丢失，会增大蛋白质组重复性分析的误差。通过首先分离纯化亚细胞器，然后富集其中的蛋白或蛋白复合物可降低蛋白质组的复杂程度、提高蛋白检测的灵敏度，并有助于了解蛋白在细胞内的定位分布等。采用免疫学方法去除样本中的高丰度蛋白，也会有利于低丰度蛋白的检出。尽管2D-PAGE法仍存在着一些局限，但由于其方法简便、分辨率高，目前仍是分离蛋白质组的重要手段之一。为进一步提高2DPAGE的灵敏度、分辨率及重复性，Unlii等建立了双向荧光差异凝胶电泳法(two-dimensionaldifferencein-gelelectropho-resis，2D-DIGE)。这种方法用不同的荧光染料标记所要比较的蛋白质组样品，在同一块电泳胶上分离，并定量比较表达量有差异的蛋白，具有重复性好、灵敏度高及能与质谱联用鉴定蛋白质等优点。但其缺点是难以对多个蛋白质组同时进行比较，而且由于试验仪器、分析软件、检测试剂等相对昂贵，不利于普及。2.2质谱质谱是鉴定蛋白的最常用技术。20世纪初期英国物理学家Thomson等的工作奠定了质谱分析的基础，Thomson并因此获得了1906年的诺贝尔物理学奖。最初的质谱仅能分析挥发性小分子物质，随着离子化技术的出现，使质谱测定极性强、难挥发的生物蛋白大分子得以实现。质谱分析目前已成为鉴定蛋白最常用的核心技术，具有快速、灵敏、重复性好、自动化程度高等特点。值得指出的是质谱技术不是直接分析完整的、未经裂解的蛋白分子，而主要是分析经特异的蛋白酶(如胰酶)水解后得到的肽段混合物。质谱分析的主要步骤包括样品气化、分离、检测及数据处理等。其原理是将所要分析的样品在离子化装置内从分子形式转化为气态离子，然后根据不同离子间的质荷比(mass-to-chargeratio，m/z)差异来确定离子化分子的相对质量，从而获得1个蛋白或多肽的分子质量。不同的蛋白分子有其固有的分子质量，每个蛋白分子的氨基酸组成、序列及翻译后修饰方式的不同都可通过蛋白的分子质量反映出来。因此对组成蛋白的多肽或氨基酸的分子质量测定就是对蛋白的结构、性质及种类的分析与鉴定。质谱主要用于分析蛋白质组中蛋白的种类或蛋白复合物的组成、对蛋白进行定性定量、研究蛋白之间的相互作用、测定蛋白翻译后加工修饰的方式等。串联质谱可用来测定蛋白肽段的氨基酸序列，主要是先用特异的蛋白内切酶水解蛋白样品，对产生的特征性肽段的质量进行质谱测定后，再将某一特定质荷比的肽段离子化，并做进一步的质谱分析。通过将质谱测定结果与蛋白多肽数据库中已知蛋白肽段的序列进行比较，就可判定被测肽段的序列对应的蛋白序列。因此，可以说完整、准确的蛋白生物信息数据库是完成质谱鉴定蛋白分子全序列所必需的。此外，MS/MS还可用来鉴定蛋白翻译后的修饰位点，如磷酸化、糖基化、甲基化及乙酰化位点等。目前，传统的Edman降解测序法已基本上被质谱法所取代，如今质谱法已成为大规模蛋白测序的主要工具。质谱除了可用于测定蛋白或肽段的序列，还可进行蛋白定量分析，常用的方法有：同位素标记亲和质谱、同位素标记相对及绝对定量质谱、细胞培养稳定同位素标记氨基酸质谱及绝对蛋白定量质谱等。质谱分析目前只能分离气态化的离子，蛋白消化不完全或肽段离子化不充分均会导致质谱分析出现假阴性的结果。尤其是当2种蛋白的氨基酸序列差异很小时，质谱也很难准确地将它们区分鉴定。细胞膜蛋白的水溶性差，与胞浆蛋白相比其含有的胰酶裂解位点较少，酶解后产生的疏水性肽段不易分离，因此质谱分析通常只能鉴定出一部分膜蛋白，难以全面客观地反映出某一蛋白质组中膜蛋白的真实数量。另外，细胞内不同蛋白之间表达量差异很大，而且目前蛋白质还不能像DNA分子那样被扩增，因此高表达量的蛋白易被检出，而低丰度蛋白则易被漏检，如采用质谱技术来系统地分析组织、血清或其他体液的蛋白质组仍有一定的困难。因此如何完整精确地检测出蛋白质组中的所有蛋白，是目前质谱分析所面临的一个巨大挑战。2.3酵母双杂交系统酵母双杂交系统是由Fields等(1989)首先报道，主要用于研究蛋白之间的相互作用。其工作原理是基于酵母基因的启动子序列可被转录激活因子所识别，从而诱导位于启动子下游的报告基因表达。真核细胞的许多转录激活因子含有2个功能区：一个是DNA结合区，能与启动子序列结合；另一个是激活区，能活化启动子。仅含有DNA结合区或启动子激活区的蛋白均无法激活启动子，所以位于启动子下游报告基因的表达为阴性。可构建表达DNA结合区与诱饵蛋白Y融合的载体，同时构建表达启动子激活区与猎物蛋白Z融合的载体，然后将它们同时引入含有特定启动子和报告基因的酵母细胞中，使它们在一个细胞内同时表达以上2种融合蛋白。若蛋白Y与Z之间能相互作用，则启动子会被激活，诱导其下游报告基因的表达，因此通过检测报告基因是否表达，就可推断蛋白Y与Z之间是否存在着相互作用的关系。2H系统可用来研究多种未知蛋白与一个已知蛋白间的相互作用。这一系统具有高通量、便于自动化等优点，可广泛用于大规模研究细胞内蛋白之间的相互作用。其主要缺点是容易出现假阳性和假阴性，阳性结果常需要采用其他方法像pull—down免疫共沉淀来进一步验证，而假阴性结果则可能是由于人的某些蛋白在酵母细胞内易于降解或不能进行正常的折叠所致。另外传统的Y2H系统只能检测位于细胞核内的蛋白问的相互作用，难以研究膜蛋白或细胞浆内蛋白间的相互作用。为了克服其局限性，Snider等(2010)建立了膜酵母双杂交系统(membraneY2H)来检测膜蛋白与膜蛋白或膜蛋白与细胞浆蛋白之间的相互作用。2.4生物信息学蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。瑞士的SWISS-RPOT拥有目前世界七最大、种类最多的蛋白质组数据库。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便、有效的计算机分析软件；特别值得注意的是，蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速，如SWISSPROT、Rockefeller大学、UCSF等都有自主的搜索软件和数据管理系统。最近发展的质谱数据直接搜寻基因组数据库使得质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂的拼接方式。基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。另外，对肽序列标记的从头测序软件也十分引入注目。2.5蛋白质微阵列技术DNA微阵列技术并非蛋白质组技术的范畴，但是却不失为大规模研究蛋白质功能的一种好方法。通常在转录中受到协同调控的基因将编码同种功能的蛋白质，如果某一段DNA序列与已知功能的DNA序列在很大程度上相同，说明它们编码的蛋白质的功能也可能相同，例如酵母细胞中与细胞分裂周期和芽孢形成相关的基因可能编码功能相同的蛋白质。蛋白质微阵列技术已经发展起来，蛋白质样品以纳升小滴共价吸附在玻璃、硅、塑料等载物片上，每一个载物片可以点10000个样品，可用于鉴定一个生物有机体的全部修饰酶。例如：蛋白质微阵列技术已经检测出酵母中近乎全套的蛋白激酶。微阵列正被广泛利用调查包括植物生理时钟、植物防卫及对环境的压迫力反应、水果成熟、植物光敏色素的信号、种子发芽等生物学的争议范围。3蛋白质组学的应用蛋白质组学可用于研究与生命科学有关的许多领域，如基础医学、临床医学、生物医学及医药工业等。研究蛋白质组