《体外受精和早期胚胎培养》..

试管动物技术概念指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育成早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。试管牛（两头小牛）海福特肉用牛蒙古黄牛荷斯坦奶牛意义（以良种牛的繁育为例）采集良种母牛的卵母细胞卵母细胞的体外培养采集良种公牛精子精子体外获能体外受精良种牛体外受精胚胎胚胎移植受体牛良种犊牛成熟期牛屠宰加工厂市场采集卵巢中的卵母细胞“试管牛”工厂化生产的技术流程图（如黄牛）意义大量节省购买种畜的费用加速了良种畜的繁殖速度一、体外受精（2）过程：（一）卵母细胞的采集和培养（二）精子的采集和获能（三）获能精子和卵细胞的受精1、体外受精（1）概念：采取雌性动物的卵细胞和雄性动物的精子，使其在试管受精。“试管动物”（一）卵母细胞的采集和培养对不同动物,采取卵母细胞的方法不同一是：活体采卵二是：从已屠宰的母畜的卵巢中采卵牛活体采卵示意图（一）卵母细胞的采集和培养对不同动物,采取卵母细胞的方法不同一是：活体采卵二是：从已屠宰的母畜的卵巢中采卵牛活体采卵示意图牛卵巢、卵母细胞和体外受精胚胎牛卵母细胞牛卵巢体外受精胚胎（一）卵母细胞的采集和培养1.活体卵巢上采集超排处理：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后可A:从输卵管中冲取卵子。B:借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜等工具直接采集从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。2.屠宰后卵巢上采集无菌采集，放入30～39℃灭菌生理盐水，6h内带回实验室。（1）卵巢表面卵泡卵母细胞的获得采集方法3种。①抽吸法：用注射器配上12或18号针头，以PBS为抽卵液，从卵巢表面抽吸卵泡。②切割法：用刀片反复切割卵泡，然后用PBS（添加5%的犊牛血清）沿切口反复冲洗卵巢，回收。③剥离法：剥离突出于卵巢表面的卵泡，放在卵母细胞培养液中，然后用针刺破眼科剪剪破卵泡，回收。（2）卵巢内卵母细胞的获得用单面刀片或一组特制刀片对卵巢深层组织进行切割。可获得更多的COC。（二）精子的采集和获能1.精子采集方法•假阴道法•手握法•电刺激法•动物被处死后，从附睾尾收集精液（啮齿类的实验动物）家畜采精用假台畜2.精子的获能处理培养法：化学诱导法：人工配制的获能液处理（啮齿类动物、家兔、猪等动物精子）一定浓度的肝素溶液或钙离子载体A23187溶液处理（牛、羊等动物精子）（三）体外受精在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程新鲜或解冻的精液精子离心处理精子获能处理二、胚胎的早期培养1.培养液：两盐：无机盐、有机盐类两素：维生素、激素两酸：氨基酸、核苷酸一清：动物血清2.用于胚胎移植的胚胎一般在原肠胚以前。不同胚胎移植的时间：动物胚胎移植时间牛、羊桑椹胚阶段或囊胚阶段小鼠、家免桑椹胚之前8～16个细胞阶段人试管胚胎在保温瓶中存放（生理盐水）抽取卵母细胞检查卵母细胞二氧化碳培养箱卵母细胞成熟培养从屠宰场收集卵巢冷冻精子将解冻的精子离心分离胚胎培养精子获能受精解冻离心前离心后受精卵检查注获能液成熟卵子牛体外受精胚胎工厂化生产流程图无菌采集卵巢，放入30～39℃灭菌生理盐水，6h内带回实验室。将获得的卵母细胞进行分级，至少有包被1层以上致密卵丘细胞、形态正常的卵母细胞才可进行成熟培养。在选择卵母细胞时，无论用哪种方法采集到的卵母细胞，外围一般都应该有数层卵丘细胞所包围，形成一个叫卵丘复合体的结构（COC）。这种结构对于卵母细胞在体外条件下的成熟是十分重要的。在对家畜体外受精的操作中，一般把未成熟的卵母细胞分成A、B、C、D四级。对A级卵母细胞要求是有3层以上的卵丘细胞包围，卵母细胞的细胞质均匀；B级是少于3层卵丘细胞，但卵母细胞质要均匀；C级为没有卵丘细胞包围的卵母细胞，又称裸卵，培养效果很差；D级是退化或死亡的卵母细胞，应淘汰。A、B两类卵母细胞培养效果较好。发情期牛输卵管液中氨基多糖（GAG）是牛精子体内获能的主要物质。GAG可促进精子对钙离子的吸收，从而引发顶体反应。肝素是高度硫酸化的GAG。咖啡因能够增强夺素的诱导作用。在精子获能过程，BSA可以降低精子顶体膜中胆固醇的浓度，有利于顶体反应。精子获能之后，BSA可促进其迅速透卵子。因此，BSA作为辅助成分广泛用于家畜精子的体外获能。