实验5质粒DNA的双酶切

实验五：质粒DNA的双酶切与电泳检测一、实验目的通过本实验掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法二、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个核苷酸组成的特定序列寄主控制的限制与修饰现象多种细菌能合成限制性内切酶，这是它们保护自己，降解外来DNA分子的重要手段。细菌细胞内的DNA由于相应序列上的A或C碱基的甲基化而不被限制性内切酶攻击，而外源DNA一旦进入细胞则立即被识别，双股DNA螺旋都被切断。限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型特性I型酶II型酶III型酶限制和修饰活性单一多功能的酶单一的成分2种不同的亚基蛋白质结构3种不同的亚基单一的成分2种不同的亚基辅助因子ATP、Mg2+、Mg2+ATP、Mg2+、寄主特异性位点序列EcoB:TGANTGCT旋转对称EcoP1:AGACC切割位点距特异性位点至少位于特异性位点距特异性位点序列特异性切割不是是是在DNA克隆中的用途无用十分有用有用Ⅰ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。Ⅲ型限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。Ⅱ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链，是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。识别的专一核苷酸顺序最是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。Ⅱ型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5’……G’AA|TTC……3’3’……CTT|AA’G…...5’|表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序。‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成两个DNA片段，各有一个单链末端，两条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”平头末端：Ⅱ型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是：5’……GAT’|ATC……3’3’……CTA’|TAG……5’切割后形成两种片段，片段末端同样可以通过DNA连接酶连接起来•DNA的纯度•DNA的甲基化程度•酶切消化反应的温度•DNA的分子结构•溶液中离子浓度及种类•缓冲液的pH值影响限制性内切酶活性的因素双酶切的两种酶介绍XhoⅠ酶（TaKaRa公司）识别序列和切割位点：EcoRⅠ酶（TaKaRa公司）识别序列和切割位点：三、仪器、材料与试剂水浴锅移液枪和枪头制冰机浮板R-pGEX-4T-1质粒DNAXhoⅠ酶EcoRⅠ酶10×HBuffer无菌水小离心管•DNAmarker2000（TaKaRa公司）•琼脂糖•1×TAE•10mg/mL溴化乙锭溶液（EB）（0.5μg/mL终浓度，20mL胶加1μL）•10×LoadingBuffer:1%SDS/50%Glycerol(甘油)/0.05%BromophenolBlue(溴酚蓝)四、实验步骤1.质粒DNA的双酶切反应体系：反应条件：温度37℃，酶切1.5h10×HBuffer2μL质粒DNA10μL～12μL≤1μg无菌水6μL～4μLEcoRⅠ1μLXhoⅠ1μL总体积20μL（无菌水补至总体积）25°C37°C2.琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果制备1％琼脂糖凝胶（含0.5μg/mLEB），120V电泳20分钟（最高电压不超过5V/cm）。3.凝胶成像系统记录结果（电泳图）［注定事项］1．分子克隆是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。2．要注意酶切时加样的次序，一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂，最后才加酶液。取液时，Tip头要从溶液表面吸取，以防止Tip头沾去过多的液体与酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱，防止限制性内切酶的失活。3．凡用在酶切反应中的一切塑料器皿（Eppendorf管，Tip头等），都要新的，最后用重蒸水清洗，湿热灭菌，置50℃温箱中烘干，使用前打开包装，用镊子夹取，不直接用手去拿，严防手上杂酶污染。4．当样品在37℃与65℃保温时，要注意：（l）防止因盖子未盖严密使水汽进入管内，使反应溶液体积大量增加，造成实验失败。（2）防止由于标签脱落，分不清样品类型。5．由于温差原因，往往在盖上有水汽，因此样品酶切完毕或中间取样电泳要离心2秒钟，以集中体积内溶液，否则会发现酶切后体积少了。每组4人，全班约7～8组。选择上次实验提取的质粒DNA（检测时条带较亮的）进行实验。移液枪和枪头每组1套。浮板每班2块。全班制备1块30mL1％琼脂糖凝胶。实验分组五、思考题Ⅱ型限制性内切酶识别序列的特点是什么？这种酶的切割有两种方式，两种切割方式分别产生怎样的末端？影响限制性内切酶活性的因素有哪些？［注定事项］1．分子克隆是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。2．要注意酶切时加样的次序，一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂，最后才加酶液。取液时，Tip头要从溶液表面吸取，以防止Tip头沾去过多的液体与酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱，防止限制性内切酶的失活。3．凡用在酶切反应中的一切塑料器皿（Eppendorf管，Tip头等），都要新的，最后用重蒸水清洗，湿热灭菌，置50℃温箱中烘干，使用前打开包装，用镊子夹取，不直接用手去拿，严防手上杂酶污染。4．当样品在37℃与65℃保温时，要注意：（l）防止因盖子未盖严密使水汽进入管内，使反应溶液体积大量增加，造成实验失败。（2）防止由于标签脱落，分不清样品类型。5．由于温差原因，往往在盖上有水汽，因此样品酶切完毕或中间取样电泳要离心2秒钟，以集中体积内溶液，否则会发现酶切后体积少了。在酶切实验中需要注意的事项1反应Buffer2酶切位点的保护碱基3酶切反应温度4酶切体系的体积