慢病毒介导的RNAi技术

慢病毒介导的RNAi技术一、概述慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。和一般的逆转录病毒载体不同，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。并且它可以有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，因此具有广阔的应用前景。目前慢病毒被广泛地应用于RNAi的研究中。由于体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体,然后转入细胞内转录siRNA的策略，不但对基因表达抑制效果不逊色于体外合成siRNA，而且稳定整合表达载体的细胞中，可以发挥长期阻断基因表达的作用。但上述两种方法，一是受到转染试剂转染效率的影响，在一些细胞内无法有效敲低（Knockdown）一些基因；二是传统方法得到稳定细胞株通常需要挑取单克隆，进行克隆化，这样费时费力。利用慢病毒介导的方法可以解决上述问题，这是因为慢病毒介导的RNAi具有下述优点：●慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，不存在某些细胞难以转染的问题。●慢病毒可以在细胞基因组上稳定整合表达siRNA的元件，siRNA表达效率比较均一，因此，无需挑取单克隆。●慢病毒载体具有嘌罗霉素（Puromycin）抗性基因，Puromycin可以在2-3天内杀死细胞，只有整合了病毒载体的细胞能够存活，这样缩短了得到稳定细胞株的时间。慢病毒表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带polyA尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stemloop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(smallhairpinRNA,shRNA)，载体内的位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5Ｔ转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后可折叠成具有1~4个U3’突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。慢病毒介导的RNAi和其它方法的比较见图1。二、pLKO.1载体美国RNAi协作组（TheRNAiConsortium）已经利用pLKO.1载体骨架构建了针对15,000个人类基因和15,000小鼠基因的shRNA库，详细信息见文献Moffatetal.,Cell2006Mar;124(6):1283-98。pLKO.1是一种复制缺陷型慢病毒载体，它可以直接通过转染操作被导入细胞，作为常规RNAi载体使用，也可被包装成慢病毒颗粒，然后感染细胞。一旦进入细胞，整合到基因组，便可以稳定表达shRNA和具有Puromycin抗性，Puromycin筛选可以杀死没有稳定整合慢病毒载体的细胞，得到稳定整合的细胞系。图2，3分别为pLKO.1载体的图谱和shRNA的示意图。元件注释5’LTR5’长末端重复序列（longterminalrepeat）RRERev反应元件，介导转录本出核，从而被有效包装U6人类U6启动子，RNA聚合酶Ⅲ可以识别，指导下游shRNA转录shRNAinsert小发卡RNA插入片断cPPTCentralpolypurinetract，促进载体片断入核，提高整合效率hPGK人类磷酸甘油激酶启动子，指导puromycin抗性基因的组成性表达PuroR表达的蛋白使细胞具有puromycin抗性，方便选择sin3’LTR3’失活长末端重复序列F1orif1细菌复制起点AmpR氨苄青霉素抗性基因pUCoripUC细菌复制起点三、shRNA寡核苷酸序列的设计和合成A.设计确定一段合适的21个碱基的靶序列是有效的敲低某个基因的非常重要的第一步。现在一些互联网上的服务器能够帮助提供一些线索。例如，由Whitehead生物医学研究所（TheWhiteheadInstituteforBiomedicalResearch）设立和维护的siRNAext程序（），登记个人信息后，便可免费使用。下面为一些设计siRNA的基本原则：1.从起始密码ATG下游25个核苷酸后开始，寻找21个核苷酸，排列模式符合AA(N19)。如果没有符合上述模式的序列，可以寻找符合NAR(N17)YNN这种排列模式。N为任一核苷酸，R为嘌呤，Y为嘧啶。2.GC含量介于36%-52%。3.“sense”链3’端稳定性较低，在15-19核苷酸位置，至少有一个A或T。4.避免靶向内含子。5.避免21个核苷酸内有连续4个或更多重复的核苷酸，尤其避免重复的T，因为重复的T可以导致RNA聚合酶Ⅲ转录终止。为了避免设计的siRNA有靶向其它基因的脱靶（off-target）效应，需要进一步利用NCBI的BLAST程序进行同源性搜索，选择至少和其它基因序列有3个错配的序列。（通常需要选择多条序列来靶向同一基因，一是为了选择比较有效的siRNA序列，二是为了避免不可预知的脱靶效应，如果两条siRNA引起了相同的细胞表型改变，通常可以消除脱靶效应的疑虑。B.合成：一旦确定了靶序列，可以将靶序列放入下面的基本骨架：正向寡核苷酸（Forwardoligo）5’CCGG-21个碱基（靶序列）-CTCGAG-21个反向互补碱基序列-TTTTTG3’反向寡核苷酸（Reverseoligo）5’AATTCAAAAA-21个碱基（靶序列）-CTCGAG-21个反向互补碱基序列3’基本骨架内红色标记的核苷酸为必须存在的核苷酸，这样，退火（Annealling）以后，寡核苷酸两端会形成以后能够连接入载体的粘性末端。举例如下：如果靶序列为：AA（TGCCTACGTTAAGCTATAC）。合成的寡核苷酸应为如下序列：正向寡核苷酸（Forwardoligo）5’CCGGAATGCCTACGTTAAGCTATACCTCGAGGTATAGCTTAACGTAGGCATTTTTTTG3’反向寡核苷酸（Reverseoligo）5’AATTCAAAAAAATGCCTACGTTAAGCTATACCTCGAGGTATAGCTTAACGTAGGCATT3’上述寡核苷酸合成规格为100nmol，纯化方式为PAGE纯化。四、siRNA序列克隆入pLKO.1载体酶切pLKO.1克隆载体，合成的正向和反向寡核苷酸退火以后形成寡核苷酸双链，两端具有和酶切后的载体兼容的粘性末端，经过连接反应，便能产生含有shRNA序列的pLKO.1载体。A.实验材料AgeI(NEB,#R0552S)，EcoRI(NEB,#R0101S)，Buffer2(NEB,#B7002S)，SolutionI(Takara,D6022)，琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（QIAGEN，#28704），1.5ml微型离心管（Biologix,货号：80-1500）。B.寡核苷酸退火溶解合成的寡核苷酸，终浓度20µM（高压灭菌水溶解核酸，水的体积=（合成得到的核酸nmol数X50）µl），按照表2反应体系在1.5ml微型离心管内配制反应。在1L烧杯内准备700-800ml温度为95oC-100oC的水，将微型离心管置入烧杯，放置于试验台上，缓慢降温至室温，这个过程约需要2小时。表2：退火反应体系5µlForwardoligo5µlReverseoligo5µl10xNEBBuffer235µlH2OC.酶切pLKO.1克隆载体1.首先用AgeI酶切，反应体系如下：4µgpLKO.1克隆载体5µl10XNEBbuffer12µlAgeI补水至总体积50µl37oC水浴孵育1小时。2.用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化酶切反应产物，30µlH2O洗脱。3.纯化产物用EcoRI酶切，反应体系如下：30µlAgeI酶切产物5µl10XNEBbufferforEcoRI2µlEcoRI13µlH2O37oC水浴孵育1小时。4.在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离酶切后载体，可看到一约7kb的片断（AgeI和EcoRI酶切会切出约60bp的寡核苷酸，在0.8%的凝胶上无法看到），切胶，回收，30µlH2O洗脱。5.测量核酸浓度。D.连接和转化按照下述反应体系配制连接反应：2µl退火的寡核苷酸双链（步骤四.B）1µl20ng/µl酶切的pLKO.1克隆载体2µlH2O5µlsolutionI22oC孵育15分钟，然后进行转化：取5µl连接产物加入50µl感受态细胞内，冰上放置30分钟，42oC水浴90秒，速置于冰上2分钟，将感受态细胞涂布于氨苄平板上。16小时后可见有白色克隆。同时，如果第一次使用酶切载体，推荐进行一个对照连接反应，不加寡核苷酸双链，用水补齐体积，酶切良好的载体为对照连接反应没有克隆或1-2个克隆，而加入寡核苷酸的连接反应可以得到10个以上的克隆。E.阳性克隆的鉴定挑取3-5个克隆，提取质粒，通过酶切和测序来鉴定阳性克隆。1.酶切鉴定1µg质粒2µl10XNEBbufferforEcoRI0.8µlEcoRI0.8µlNcoI补水至总体积20µl37oC水浴孵育1-2个小时。电泳可以见到2kb和5kb的两个片断。2.测序鉴定有时因为碱基修饰的原因，质粒不能被切开，这时可以通过直截测定序列的方法来鉴定。酶切鉴定得到阳性克隆后，进一步需通过测序的方法来证实寡核苷酸序列是否正确。测序引物为5’CAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGA3’。五.制备病毒颗粒进行这些实验的实验室必须具有操作HIV和HIV相关病毒的资质和经验。pLKO.1载体可以被作为常规载体使用，通过转染操作导入细胞，瞬时敲低基因。如果希望得到稳定敲低基因的细胞系，则需要用pLKO.1载体包装成病毒颗粒，然后感染（infect）细胞，用puromycin筛选基因组稳定整合shRNA序列的细胞。下面以转染60mm培养皿为例进行说明，如果需要更大量的病毒液，可以按比例扩大规模。第一天：种植细胞，在60mm培养皿内种植7x105的HEK-293T细胞，培养基体积为4ml。第二天：转染，在细胞种植16-24小时后进行转染操作，可以按照所在实验室常规转染293T的方法进行转染，也可选用前景科创公司的293Fect（专业转染293细胞的转染试剂），方便快速。下面转染操作以293Fect为例说明：第三天：细胞过夜培养后，换用新鲜培养基（旧的培养基需要经过10%漂白剂处理后才能丢弃）。24小时后，观察293T细胞，如果细胞状态不好，约有20%-30%的细胞死亡，此时收集培养基（已经有慢病毒产生），置于15ml离心管内（Biologix,货号：10-0151），存放于4oC。否则，可继续等待直至48小时，待细胞状态如上面描述时，收获培养基。第四天：收获一次慢病毒后，可继续加入4ml新鲜培养基，24小时后再收获一次病毒。将两次收获的病毒液合并，1250rpm，离心5分钟，将细胞碎屑离心至管底，取上清感染细胞或者冻存。也可用孔径为0.45µm的针头滤器过滤去除293T细胞。病毒液在4oC可以存放几天，如需长期保存，需要分装后冻存于-80oC。