细胞培养基础知识

细胞培养基础知识InvitrogenProprietary&Confidential2价值和信任的历史GIBCO自1962年开始生产用于细胞培养的动物血清，是此行业的开创者。在四十年的岁月里，一直保持在技术和品质方面的领先水平。血清和培养基的市场占有率常年蝉联全球第一。GIBCO血清生产的纵向整体化管理从血液收集到最终产品检验和内部稽核的每一个步骤，GIBCO都采用专用设备和标准操作程序。这种严格的控制可保证产品的高品质和最低的批间差。可追踪性：血清品质的证据GIBCO收集并保留从采血、处理、检测到发运的全部文件供追踪之用。Gibco品牌InvitrogenProprietary&Confidential3细胞培养相关设备CO2培养箱，水浴，离心机，液氮罐，显微镜InvitrogenProprietary&Confidential4细胞培养基本流程基础培养基+FBS+添加剂+抗生素去除Media用PBS清洗加入Trypsin以分离贴壁细胞将部分细胞传代到新的Media中InvitrogenProprietary&Confidential51.细胞培养主要成分①基本培养基②血清③细胞培养试剂（抗生素、细胞解离，生长因子等）④平衡盐溶液⑤真核细胞InvitrogenProprietary&Confidential6培养基必须提供所有基本的营养InvitrogenProprietary&Confidential7经典培养基的应用BME(BasalMediumEagle):是由Eagle发明的，是最简单的培养基，只有11种氨基酸和盐及一些维生素。最先用于培养小鼠的L细胞和人类HeLa细胞，现在广泛用于各种细胞的培养EMEMorMEM(Eagle’sMinimumEssentialMedium):是BME的升级版，氨基酸浓度是BME的两倍，适用于更多的细胞DMEMorDME(Dulbecco’sModificationofEagle’sMedium)是Dulbecco改进的MEM.氨基酸和维生素浓度是BME的4倍.最先葡萄糖的浓度是1g/L，称为低糖DMEM,后来增加到4.5g/L，称为高糖DMEM，广泛用于各种细胞培养。InvitrogenProprietary&Confidential8经典培养基的应用M199(Medium199):是一种比较古老的，配方复杂的，含有核苷酸，核酸等成分的培养基。最初用于鸡胚肌细胞的培养，还用于各种细胞的维持和病毒生产RPMI1640(RoswellParkMemorialInstitute#1640):是McCoy’s5A的改进版，含有高浓度的肌醇。广泛用于悬浮细胞的培养。如人类白细胞，骨髓瘤细胞，杂交瘤细胞等血液来源的细胞Ham’sF10(Ham’sNutrientMixtureF10):由Ham发明，用于人类2倍体细胞和仓鼠细胞的培养。Ham’sF12(Ham’sNutrientMixtureF12):F10的升级版，含有更多的维生素，肌醇，氨基酸。用于培养大鼠，兔子和鸡胚细胞，还用于中国仓鼠卵巢细胞以及肺细胞的培养InvitrogenProprietary&Confidential9基本培养基－用途InvitrogenProprietary&Confidential10GIBCO培养基的4种形式即用型(1X)液体培养基:直接用培养基浓缩液(10Xor50X):用前需要稀释成1×干粉培养基DPM(DryPowderMedia):需要在水中溶解,加入碳酸氢钠,调pH值,然后过滤才可以用高级颗粒技术培养基AGT(AdvancedGranulationTechnologyTM):比DPM形式的培养基更容易溶解的颗粒状的培养基.AGT是完全为工业产量的用户开发的,pH提前调好了,所有的成分都提前混合好了,只需要加水溶解和过滤。InvitrogenProprietary&Confidential11优点:节省空间特性:干粉状形式节省空间需要在超纯水中溶解需要加入碳酸氢钠需要调节pH需要用0.22um的滤膜过滤缺点:•耗时干粉培养基液体培养基液体形式直接可以使用不需要另外加入其他成分不需调pH不需过滤•什么东西都不需要自己准备•不需调pH•高价值•费空间•高价格InvitrogenProprietary&Confidential12培养基的保存及运输干粉：2年液体：10个月浓缩液体：12个月所有的培养基都必须在2～8℃，避光保存，不能冷冻，干粉培养基可在室温情况下运输。InvitrogenProprietary&Confidential13含有L-Glutamine的液体培养基–12个月不含L-Glutamine的液体培养基–18个月干粉培养基，3年培养基的保质期InvitrogenProprietary&Confidential14GIBCO培养基的类型传统培养基要添加血清(5-10%)的培养基高级培养基（Advancedmedium）浓缩了营养物质和其他成分的培养基,只需要2%的血清(减少50-90%)减少不同批次血清带来的差异和试血清的麻烦,节省时间和花费无血清培养基(无血清培养基/无蛋白培养基/化学定义的培养基)使用时无须再填加血清,主要用于生物产品生产,干细胞研究等专用培养基针对角质细胞、淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肝细胞、神经元细胞、胚胎干细胞、CHO细胞、293细胞、各类昆虫细胞、杂交瘤细胞、羊水细胞等的无血清培养基InvitrogenProprietary&Confidential15血清－血清的作用•附着因子—纤连蛋白，提高粘性•增殖、分化所需的激素和生长因子•调节膜的渗透性•生长因子、脂类、酶和微量元素的载体•缓冲液•毒素灭活作用•保护作用:pH波动,蛋白酶,有毒试剂,机械损伤InvitrogenProprietary&Confidential16GIBCO动物血清的种类•胎牛血清(FBS):-原产地（美国；澳大利亚；巴西；新西兰等）-经过鉴定的(certified)vs质量有保证的(qualified)•新生牛血清(NBS):-出生少于十四天•小牛血清:-出生少于一年•捐献血清:-特殊饲养的，专门用来进行血清提取的牛•其他血清:-horse,chicken,goat,lamb（羊）,porcine（猪）,rabbitInvitrogenProprietary&Confidential17血清－血清的类型•热灭活:(在56℃水浴30min)–热灭活一些可以产生免疫应答反应的物质（补体等）–在昆虫细胞培养和胚胎干细胞培养中需要•透析:–透析掉小分子量的物质–离子，氨基酸–用于标记•低IgG:我们有自己独特的层析技术去除γ球蛋白–经过处理将IgG去除–用于免疫学研究及其生产生物制品•胚胎干细胞专用:–胚胎/间充质干细胞专用–维持干细胞处于为分化状态•γ-射线照射处理的血清(客户订制)InvitrogenProprietary&Confidential18血清－CertifiedFBSVsQualifiedFBSCertifiedFBS和QualifiedFBS都通过以下测试无菌，醋酸纤维素介质中的电泳图谱，渗透压，pH值，总蛋白，病毒检测，内毒素和支原体对Certified胎牛血清，除以上检测外，还进行如下检测：噬菌体检测；生物化学检测（碱性磷酸酶等21项内容）；激素检测（雌二醇等5项内容）；Sf9细胞生长InvitrogenProprietary&Confidential19血清－可追踪性：血清品质的证据GIBCO收集并保留从采血、处理、检测到发运的全部文件供追踪之用血清通常具有3-5年的保质期血清的性能可能会随着每批，和季节的不同而不同在拿到每一批血清前应该进行验证通常,购买一次血清最好足够1-2年使用，确保每一瓶都一样，而不需要每次都进行验证InvitrogenProprietary&Confidential20培养效能检测对所有的胎牛血清，GIBCO都进行以下培养效能检测。选择胎牛血清的最重要的标准是其支持特殊的细胞生长的能力，因此，除了保证血清通过严格的品质控制，GIBCO也同时在实验室条件下对血清的三个重要的培养效能进行检测：集落效率检定：分析每一批胎牛血清促成单一细胞集落的能力，及促进老鼠骨髓瘤细胞及其衍生的融合瘤细胞的生长能力。实际应用在低密度非贴附性细胞的集落形成、融合瘤发育以及单克隆抗体的制造。贴附效率检定：利用一贴附的、已转型的人类细胞株来检测每一批血清促使低密度细胞贴附及分裂的能力。实际应用在低密度或正常密度、转型细胞株及细胞株的繁殖。二倍体成纤维细胞生长促进检定：评估每一批血清能维持难培养的贴附细胞长期生长的能力。培养数代WI-38人类二倍体成纤维细胞，计算每一代培养的细胞总数。此项检测所挑选出的胎牛血清批号能维持难以生长的细胞、贴附性细胞、正常的细胞株的生长及存活。此外，对部分胎牛血清，我们也进行昆虫细胞生长促进检定：评估每一批Certified等级胎牛血清，及特定批号的Qualified等级的胎牛血清其促进SF9昆虫细胞生长的能力。此项测试为选择适合昆虫细胞生长及BEVS实验的胎牛血清最佳指标。InvitrogenProprietary&Confidential21其它检测对Certified胎牛血清，除以上检测外，还进行如下检测：噬菌体检测；我们利用适当的大肠杆菌，例如K12，进行噬菌体溶菌斑记数分析。此检测可以了解胎牛血清收集与制造过程的产品质量，噬菌体浓度高表示胎牛血清的原料处理有问题。生物化学检测（碱性磷酸酶等21项内容）；激素检测（雌二醇等5项内容）；血红蛋白检测其它对EScell-QualifiedFBS,要进行特殊检测以确定对胚胎干细胞未分化的细胞形态的维持能力。对小牛血清和新生牛血清，我们进行其对VERO细胞生长的支持能力的检测；对马血清，我们进行其对Sp2/O-Ag14细胞生长的支持能力的检测；对部分血清，我们也进行细胞毒性的检测。InvitrogenProprietary&Confidential22有关血清的常见问题1.保存血清最好的方法?我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。然而，若存放于4℃时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。2.如何解冻血清才不会使产品质量受损?我们建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。3.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。InvitrogenProprietary&Confidential234.为什么要热灭活血清?加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。5.有必要做热灭活吗?实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热处理这一步。如此一来，不但节省您宝贵的时间，更确保血清的