细胞培养技术考试答案

一、名词解释1、细胞培养技术：指从体内组织取出细胞在体外模拟体内的环境使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术2、原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。3、传代培养：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。4、细胞系：原代细胞首次传代成功后即可成为细胞系5、细胞株：通过选择法或克隆法形成法从原代培养物或细胞系中获得特殊性质或标志，并保持这些特性的培养物。二、简答题1、细胞冻存与复苏要点与注意事项细胞冻存要点(1)冷冻过程要缓慢.需要冷冻保存的细胞先在4℃冰箱中放置30-60分钟;然后转入-20℃,放置30分钟;然后再转入-80℃放置16-18小时(或过夜);最后放入液氮中长期保存.有条件的地方,可用程控降温仪,按每分钟-1到-3℃速度降温,一直到-80℃以下,然后直接放入液氮中长期保存.(2)冻存细胞必须处在对数生长期,活力大于90%,无微生物污染.(3)细胞浓度控制在:1×107-5×107/ml.(4)使用高浓度血清或蛋白保护剂.一般情况下,用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于20%.(5)使用合适的细胞冷冻保护剂,以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏.目前,最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜),使用终浓度为5-10%.但是,有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂,如人白血病细胞系HL-60.因为,DMSO能诱导HL-60细胞分化.在这种情况下,可选用其它冷冻保护剂,如甘油(glycele),羟乙基淀粉等.注意事项(1)细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1小时,以防止冰晶过大而破坏细胞.也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中,但这样做细胞存活率要低一些.(2)DMSO稀释时会释放大量热量.因此,DMSO不能直接加到细胞液中,必须事先配制.(3)DMSO必须是细胞培养级别的.新买的DMSO本身处于无菌状态,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中,4℃保存.避免反复冻融造成DMSO裂解产生有害物质.并可减少污染机会.如要过滤DMSO,必须选用耐DMSO的尼龙滤膜.细胞冷冻保存液主要成分:冷冻保护剂,基础培养液,血清或蛋白.冷冻保存细胞复苏要点与注意事项:细胞复苏要点(1)从液氮中取出冻存的细胞,立即放入37℃水浴中快速解冻.(2)将1-2ml冻存细胞液加入到25ml新鲜完全细胞生长培养液中,轻轻混匀.(3)用80g离心2-3分钟,弃上清液.(4)用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团,并计数细胞.(5)接种细胞到培养瓶中,起始密度为3×105/ml.注意事项(1)解冻时务必注意安全,预防冷冻管爆裂.,要带手套,用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出,放入37℃水浴中.切不可直接用手,以免冻伤.(2)冷冻管在水浴中解冻时,液面不可超过冻存管盖面,否则,易发生污染.(3)快速解冻.冻存细胞从液氮中取出后,应立即放入37℃水浴中,轻轻摇动冷冻管,使其在1分钟内全部融化(不要超过3分钟).(4)解冻操作过程动作要轻.由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱,不仅解冻速度要快,而且动作要轻.一般情况下,解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养(1ml冻存细胞液加入到25-30ml新鲜完全培养液中),24小时后再用新鲜完全培养替换旧培养液,以去除DMSO.如果,细胞对冷冻保护剂特别敏感,那么,解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂,然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中.2、细胞培养基本条件（1）合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一,培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境.（2）优质血清目前,大多数合成培养基都需要添加血清.血清是细胞培养液中最重要的成分之一,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分.（3）无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件.在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,或者自身代谢物质积累,可导致细胞中毒死亡.因此,在体外培养细胞时,必须保持细胞生存环境无菌无毒,及时清除细胞代谢产物.（4）恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.（5）合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳.细胞培养基种类与基本成分细胞培养基的种类很多,按其来源分为合成培养基和天然培养基(目前使用的培养基绝大部分是合成培养基),按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类.干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌,液体培养基由专业商家提供,用户可直接使用,非常方便.每种细胞都有其合适的培养基,3、常用的合成培养基种类(1).MEM细胞培养基系列(2).DMEM细胞培养基系列(3)RPMI-1640细胞培养基系列(4).199细胞培养基系列(5).水解乳蛋白细胞培养基(6)欧氏平衡盐(7)F-10,F-12细胞培养基系列(8)其它类型细胞培养基4、传代细胞分散后要经历的那些阶段，什么阶段细胞继代最合适细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：1．潜伏期（LatentPhase）。细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。2．指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）：这是细胞增值最旺盛的阶段，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（DensityInhibition），导致细胞分裂停止。3．停滞期（StagnatePhase）：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。指数增生期末更适宜细胞继代5、简述细胞计数步骤1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。6、简述细胞污染的种类，及检测方法细胞污染种类有细菌，真菌，支原体，外源病毒细菌和真菌检测方法可用TG,GA，GP检测，TG浑浊表示污染细菌，GA斜面有白色污染物表示有真菌污染GP混住表示有真菌污染。支原体污染的检测支原体检测可用液体培养基和支原体固体培养基，液体培养基变色只能怀疑有支原体污染，移植后仍有同样颜色变化，或固体培养基出现荷包蛋样菌落则判断污染支原体。外源病毒检测致细胞病变病毒的检验红细胞吸附病毒的检验特定病毒的检验细胞系来源动物的原代细胞；对疫苗使用对象动物致病性病毒敏感的细胞；对相应病毒敏感的细胞。间接免疫荧光试验PCR试验7细胞传代要点与注意事项细胞传代方法贴壁细胞（1）洗掉旧培养液；（2）、用无钙镁PBS洗涤细胞一至二次；（3）、加入适量Trypsin-EDTA溶液方法一：37℃或温室作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆颗粒状时，洗掉消化液，轻敲培养瓶边缘使细胞自瓶壁脱落，然后加入适量的新鲜培养液，与脱落的细胞或细胞团块混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。方法二：37℃或室温作用数分钟，待细胞自瓶壁脱落后，加入适量含血清的新鲜培养液，以终止trypsin作用，离心后除去上清液，或不作离心处理，添加新鲜培养基后依稀释比例传至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。悬浮型细胞（1）、吸去细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm、5min（2）、吸除上清液，加入适量的新鲜培养基，与沉淀细胞混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养。细胞传代时注意事项（1）、紫外消毒过程中会产生臭氧分子，对人体有害。一般情况下，消毒后至少半个小时后再进入。（2）、所有的实验器材都要经过消毒处理，所有的细胞操作都在安全柜中进行，每一步都要注意不要用手碰到瓶口，培养液不能碰到瓶口，拿培养瓶时要使培养瓶的瓶口微微翘起。（3）、细胞消化时间不能太长，要让细胞尽快脱离不舒服的环境，补加生长液后要保证细胞完全混匀，在显微镜下观察细胞是一个一个的。（4）、传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只能进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。PBS，培养液和消化液应严格分开。（5）、每天观察细胞状态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长至致密单层后即可传代。8细胞培养目的与用途药物研究与开发(1)新药筛选:如化学合成药物药效研究,中药有效成分筛选与鉴定等.(2)疫苗研究与开发:如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等.(3)基因工程药物研究与开发:如干扰素研究与开发,细胞生长因子研究与开发等.(4)细胞工程药物研究与开发:生物活性多肽研究与开发,人参皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究与开发.(5)单克隆抗体制备:包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体.基础研究(1)药物作用机理(2)基因功能(3)疾病发生机理生物制药(1)疫苗生产:如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等.(2)基因工程药物生产:如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素,粒细胞生长因子,胸腺肽等(3)诊断用和药用单克隆抗体生产(4)细胞工程药物生产:生物细胞内的一些生物活性多肽,生物活性物质等