第二章-发酵产酶

武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第二章酶的微生物发酵生产本章主要内容：酶的生产方法；酶生物合成的基本理论；发酵产酶的工艺条件及控制；酶发酵动力学；固定化细胞和原生质体发酵产酶．难点：酶生物合成的诱导和阻遏；发酵过程细胞生长与酶合成之间的关系。重点：酶生物合成的基本理论；微生物发酵产酶工艺。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第一节酶的生产方法1894年，美籍日人高峰让吉首先从米曲霉中制备得到高峰淀粉酶（ａ-淀粉酶、他卡酶），用作消化剂，开创了近代酶的生产和应用的先例。1908年，德国的罗姆（Rohm）用动物胰脏制得胰酶，用于皮革的软化。1908年，法国的波伊定（Boidin）制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的退浆；1911年，华勒斯坦（Wallerstein）从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室1949年，日本开始采用微生物液体深层培养方法进行细菌ａ-淀粉酶的发酵生产，揭开了现代酶制剂工业的序幕。20世纪80年代发展起来的动、植物细胞培养技术，继微生物发酵生产酶之后，已成为酶生产的又一种途径。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第一节酶的生产方法一、酶的生产方法1、提取法采用各种技术，直接从动、植物细胞或组织中将酶提取出来。提取法虽简单易行，但受原材料来源的限制。2、化学合成法是20世纪60年代中期出现的新技术。只能合成那些已知化学结构的酶；成本比较高。目前仍然停留在实验室内合成的阶段。牛胃→凝乳酶胰脏→胰酶血液→凝血酶木瓜→木瓜蛋白酶武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室3、微生物发酵法是20世纪50年代以来生产酶的主要方法。利用微生物细胞的生命活动合成所需酶的方法称为发酵法。酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室二、应用微生物来开发酶的优点1、微生物种类多，酶种丰富；2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶；3、微生物培养基来源广泛，价格便宜；4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程；5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室三、酶发酵生产的类型1、液体深层发酵：液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件下发酵。2、固体培养发酵培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌株，在一定条件下发酵。3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第二节酶生物合成的基本理论一、酶生物合成的过程DNARNA蛋白质（新生多肽链）成熟蛋白质（酶）胞内胞外转录翻译加工分泌或定位武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室二、酶生物合成的调节按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类：组成酶—恒定（速度、浓度）诱导酶—在外界环境因素诱导下合成速度急增，酶浓度成百上千倍增加(适应型酶、调节型酶)武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏1、酶合成的诱导作用加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用。诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成淀粉诱导a-淀粉酶的合成武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2、酶合成的阻遏（1）终产物阻遏指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。（2）分解代谢物阻遏（营养源阻遏）是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。葡萄糖阻遏ß-半乳糖苷酶的生物合成果糖阻遏a-淀粉酶的生物合成A1B1A2B2E1E2×A→→→→→BE×色氨酸过量时会阻遏催化色氨酸合成的相关酶武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室第三节微生物发酵产酶工艺（重点）发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种提供适当的营养和生长环境，使生产菌大量增殖，同时合成所需要的酶，然后由发酵所得物料制成酶产品。现代酶制剂的大规模生产以深层液体发酵法为主。无论哪钟发酵法，都要做三方面的工作：（1）从原料准备培养基；（2）从原始菌种准备生产菌种；（3）发酵过程管理。一、发酵产酶的一般工艺流程武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室[原料][原始菌种][麸皮等原料]↓↓饼粕等原料淀粉质原料试管斜面培养(活化)[配制培养基]↓↓↓(灭菌)按不同原料净化、粉碎摇瓶等分级扩大培养作不同处理↓↓水解种子罐培养↓↓[淀粉糖液][发酵罐(液体发酵)][发酵池(固体发酵)]↓↓↓培养配制培养基↓(灭菌)[发酵液][成品曲]↓↓↓下游加工{液态酶制剂}↓{固体粗酶制剂}{各种精制酶制剂}酶发酵生产的一般工艺流程图武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室保藏菌种试管斜面培养（活化）摇瓶扩大培养种子罐培养发酵罐分离纯化酶培养基无菌空气武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室二、酶生产菌种（一）产酶菌种的要求（1）产酶量高；（2）繁殖快，发酵周期短；（3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；（4）能够利用廉价原料，容易培养和管理；（5）安全性可靠，非致病菌。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（二）、常用的产酶微生物1、细菌大肠杆菌谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等。枯草杆菌α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、5‘-核苷酸酶、碱性磷酸酶。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2、放线菌链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。3、霉菌黑曲霉：糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。米曲霉：氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。红曲霉：α-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶等。木霉：纤维素酶。根霉：糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶，脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。毛霉：蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室4、酵母啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢酶等。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（三）生产菌种的来源1、买，专利向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）；中国典型培养物保藏中心（CCTCC，又称武大保藏中心）。中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）；中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）荷兰微生物菌种保藏中心（CBS）德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）英国国家典型菌种保藏所（NCTC）武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（1）样品的采集：主要是各种富含所需微生物的土壤、水、气、枯枝烂叶、烂水果等；（2）初筛：分离产目的酶的菌株；给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株分离出来。（3）复筛：从所得菌株中筛选优良株；在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。（4）生产菌种的改良。获得高产菌种的突变体；运用基因工程的手段。产酶菌种筛选步骤：2、筛选由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（四）生产种子的制备由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用于发酵罐接种的大量菌体。1、种子制备工艺过程保藏菌种活化培养逐级摇瓶培养种子罐培养接种至发酵罐武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（1）菌种活化保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以恢复细胞的生命活动能力。方法：在试管斜面上培养1-3代。（2）扩大培养活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，以获得足够数量的优质细胞。培养基称为种子培养基。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室扩大培养应注意的事项：（1）尽量减少传代次数，以降低菌种衰退和污染的可能性；（2）培养基成分一般应比发酵培养基的氮源丰富；（3）培养时间一般控制在微生物生长的对数生长期，及时接入下一级培养或发酵罐；（4）严格控制培养条件（pH、温度、通气量等），加强培养过程的实时监测。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室三、培养基1、碳源：提供碳元素；能源碳源、氮源、无机盐、生长因素、水等。来源：淀粉及其水解物—淀粉水解糖、糖蜜、或含淀粉的原料如大米、薯类、玉米、麸皮、米糠等。此外石油产品中12碳—16碳的碳氢化合物已成功用作微生物培养基的碳源。注意：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。是人工配制的用于培养微生物的含营养物质的混合物。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2、氮源：提供氮元素来源：①有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等；②无机氮：含氮的无机化合物，如（NH4）2SO4、NH4NO3、NaNO3和（NH4）3PO4等。3、无机盐：大量元素和微量元素。基本功能：构成细胞的成分；构成酶产品的组分；作为酶的激活剂。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室4、生长因子指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等。酶制剂中所用的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、、麸皮、米糠、酵母膏等。5、水武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室配制培养基的注意事项：（1）培养基的碳氮比是培养基成分配比的重点；（2）碳源和氮源的选择，要注意避免碳分解代谢阻遏和氮分解代谢阻遏；（3）培养基中无机盐的选择要注意盐类引起的生理酸碱性反应；（4）发酵生产所用的培养基成分配比不可轻易改变。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室微生物发酵产酶培养基举例1、枯草杆菌BF7658ａ-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%豆饼粉4%磷酸氢二钠0.8%硫酸铵0.4%氯化钙0.2%氯化铵0.15%自然pH武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2、黑曲霉糖化酶发酵培养基玉米粉10%豆饼4%麸皮1%pH4.4~5.0武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室四、发酵条件的控制1、温度的调节控制（2）有些微生物生长最适温度与发酵产酶的最适温度有所不同。例：酱油曲霉生产蛋白酶，28℃时蛋白酶产量比在40℃条件下高2~4倍，在20℃条件下发酵，则蛋白酶产量更高，但细胞生长速率较慢。为此，在有些酶的发酵生产过程中，要在不同的发酵阶段控制不同的温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。（1）不同的微生物有不同的最适生长温度。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（3）温度的控制方法一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室2、pH值的调节控制（1）不同微生物，其生长繁殖的最适pH值有所不同。（2）微生物生长的最适pH值与产酶最适pH值往往不同。（3）有些微生物可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。黑曲霉α-淀粉酶糖化酶pH值中性↑↓pH值偏酸性↓↑武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室（4）影响pH值的因素a、一般来说，培养基成分中C/N比高，发酵液倾向于酸性，pH低；C/N比低，发酵液倾向于碱性，pH高。b、不同盐的利用对pH也会产生影响。（4）生产中控制pH值的方法②添加缓冲液维持一定的pH值（如磷酸盐）；①调节培养基的原始pH，保持一定的C/N比；③发酵液中pH过