基因工程的一般过程和基本操作技术程序

基因工程的主要技术环节包括：获得目的基因制备重组DNA分子转化受体细胞筛选重组细胞实现功能表达基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤：（人教版）1）目的基因的获取2）基因表达载体的构建3）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测与鉴定步骤一：获取目的基因目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。用DNA合成仪人工合成利用PCR技术扩增已知序列：从基因文库获得未知序列：步骤一目的基因的获取：基因组文库：含某种生物的全部基因部分基因文库：含某种生物的部分基因（如cDNA文库）基因组DNA文库的构建将总DNA经过酶解，分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。聚合酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)KaryB.MullisPCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸1．变性双链模板DNA解离为单链结构。（90～95℃）DNA双链DNA单链变性2．退火引物与模板互补成双链。（55～60℃）(由于引物浓度高，序列短，所以易与模板结合。)PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸引物PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸3．延伸在Taq酶作用下，合成特异DNA序列。70～75℃延伸实例1：1、下列获取目的基因的方法中需要模板链是（）A.从基因文库中获取目的基因B.利用PCR技术扩增目的基因C.反转录法D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因步骤二：制备重组DNA分子切割目的基因和质粒的限制酶是同一种限制酶吗？同一种•常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。•将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。步骤三：转化受体细胞导入植物细胞：土壤农杆菌转化法土壤农杆菌：具有趋化性（酚），感染双子叶植物和裸子植物基因枪法：单子叶植物常用的一种基因转化方法，但成本较高。花粉管通道法：十分简便经济的方法。我国的转基因抗虫棉就是用此方法获得。将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：重组DNA提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育新性状动物筛选含有目的基因的受体细胞通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入受体细胞。步骤四：筛选重组细胞1、核酸杂交技术利用DNA分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆检测方法：DNA分子杂交技术pBR322质粒结构如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活标记基因进行筛选限制性内切酶识别序列外源基因连接PStⅠPStⅠ2、抗药性筛选法：3、最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法4.目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译思考：依照中心法则分析番茄软化的原因：多聚半乳糖酸酶基因mRNA多聚半乳糖酸酶细胞壁结构被破坏番茄软化转录翻译