反胶团

第八章反胶团萃取反胶团是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，热力学稳定的有序构造。它的微小界面和微小水相有两个特异性功能：(1)具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能；(2)在疏水性环境中具有使亲水性大分子，如蛋白质等保持活性的功能。肉眼不可见溶液透明反胶团萃取技术在分离生物大分子特别是分离蛋白质方面，具有突出优点：（1）有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；（2）分离、浓缩可同时进行，过程简便；（3）能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题；（4）由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；（5）反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。第二节反胶团的形成一、反胶团的构造向非极性溶剂中加入表面活性剂时，如表面活性剂的浓度超过一定的数值时，也会在非极性溶剂内形成表面活性剂的聚集体。与在水相中不同的是，非极性溶剂内形成的表面活性剂聚集体，其疏水性的非极性尾部向外，指向非极性溶剂，而极性头向内，与在水相中形成的微胶团方向相反，因而称之为反胶团或反向胶团。图8.1是几种可能的表面活性剂聚集体的微观构造。水包油构造油包水构造尺度纳米级,肉眼不可见尺度毫米级,肉眼可见正胶团反胶团外观混浊失光外观清澈不失光极性“头”水呈现非极性的“核”（油）非极性“尾”正胶团（水包油）表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成非极性的“核”极性“头”有机溶剂极性的“核”（水）非极性“尾”反胶团（油包水）表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”3、常用的表面活性剂表面活性剂的存在是构成反胶团的必要条件，另外，还需要有有机溶剂。常用的表面活性剂及其相应的有机溶剂表面活性剂有机溶剂表面活性剂有机溶剂AOTn-烃类(C6～C10)、异辛烷、环己烷、四氯化碳、苯Brij60辛烷CTAB己醇／异辛烷，己醇／辛烷TritonX己醇／环己烷三氯甲烷／辛烷磷脂酰胆碱苯、庚烷TOMAC环己烷磷脂酰乙醇胺苯、庚烷在反胶团中有一个极性核心，被称之为“水池”。因为这个“水池”具有极性，可以溶解具有极性的分子和亲水性的生物大分子。从宏观上看，极性分子和亲水性的生物大分子好象“溶解”在非极性的有机溶剂中了。表面活性剂的存在是构成反胶团的必要条件，有三类表面活性剂，都可在非极性溶剂中形成反胶团。（1）阴离子型表面活性剂（2）阳离子型表面活性剂（3）非离子型表面活性剂表面活性剂：AOT容易获得，它具有双链，形成反胶团时无需添加辅助表面活性剂且有较好的强度；它的极性基团较小，所形成的反胶团空间较大，有利于生物大分子进入。负电荷极性头部-SO3-4、反胶团的分类1、单一表面活性剂的反胶团体系是指在使用时无须借助助剂的表面活性剂，具有多条中等长度的烷基尾和一个较小的极性头。a:阴离子型，如AOT该体系结构简单和稳定，反胶团体积较大，适用于等电点较高的、相对分子量较小的蛋白质的分离；b:阳离子型表面活性剂（如CTAB，DAP）等。该体系适用于等电点较低的、相对分子量较大的蛋白质的分离；c:非离子型表面活性剂能形成更大的反胶团体系。能分离相对分子量大的蛋白质，但这类体系容易乳化。2、混合表面活性剂反胶团体系是指两种或两种以上表面活性剂构成的体系，一般来说，混合表面活性剂反胶团对蛋白质有更高的分离效率。3、亲和反胶团体系是指除了有组成反胶团的表面活性剂以外，还有具有亲和特征的助剂，它的亲和配基与蛋白质有特异的结合能力，往往极少量亲和配基的加入就可使萃取蛋白质的选择性大大提高。二、反胶团的物理化学特性及制备1、反胶团的物理化学特性表面活性剂和非极性有机溶剂的种类、浓度；操作时体系的温度、压力；微小水池中的离子强度等，都会影响反胶团的大小。（1）反胶团的临界胶团浓度：表面活性剂在非极性有机溶剂相中能形成反胶团的最小浓度称为临界胶团浓度。见下表某些表面活性剂的临界胶束浓度／(mol／L)表面活性剂CMC表面活性剂CMCR8SO4Na0.136R12COOK0.0125R12SO4Na0.00865R12SO3Na0.01R14SO4Na0.0024R12SO4Na0.00865R16SO4Na0.00058R12NH3Cl0.014R18SO4Na0.000165R12N(CH3)3Br0.016R8O(CH2CH2O)6H9.9×10—3R12O(CH2CH2O)6H8.7×10—5R10O(CH2CH2O)6H9×10—4R12O(CH2CH2O)9H1×10—4R12O(CH2CH2O)6H8.7×10—5R12O(CH2CH2O)12H1.4×10—4R14O(CH2CH2O)6H1×10—5R16O(CH2CH2O)6H1×10—6C8H17CH2COOK0.01R16SO4Na5.8×10—4C8H17CH2(COOK)20.35R12CH(SO4Na)R31.72×10—3C10H21CH2COOK0.025R10CH(SO4Na)R52.35×10—3C10H21CH2(COOK)20.13R8CH(SO4Na)R74.25×10—3当Wo6-8时，“水池”中水的其表观粘度可增大到普通水粘度的50倍，另外，其冰点将低于0℃。当Wo16时，“水池”中的水逐渐接近主体水相粘度，胶团内也形成二重电荷层，见图8.3。AOT的Wo.max=60，若Wo值再增大，反胶团溶液变浑浊，并开始分层。（2）反胶团含水率Wo：Wo用水和表面活性剂的摩尔浓度之比来定义，即：[H2O]Wo=[表面活性剂]Wo6-8Wo16如果是AOT，则内侧呈负电荷反胶团萃取蛋白质可能的机理二、反胶团的制备制备反胶团系统一般有以下三种方法：（1）注入法：将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面活性剂的非极性有机溶剂中去，然后进行搅拌直到形成透明的溶液为止。（2）相转移法：把含有表面活性剂的有机相和含有蛋白质的水相接触，在缓慢的搅拌下，一部分蛋白质缓慢转入（萃入）有机相。（3）溶解法：将含有反胶团（W0＝3－30）的有机溶液与蛋白质固体粉末一齐搅拌，使蛋白质进入反胶团中。第三节生理活性物质的分离浓缩如图8.4所示：从宏观上看反胶团萃取，是有机相－水相间的分配萃取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。微观上，是某种产物从主体水相向有机溶剂相中的反胶团微水相中的分配萃取。一、反胶团萃取原理：一个反胶团只能容纳一个蛋白。（2）pH、离子强度、表面活性剂浓度等（如表8.1所示）因素会对反胶团萃取产生影响。通过对它们的调整，对分离场（反胶团）－待分离物质（生物大分子等）的相互作用加以控制，能实现对目的物质高选择性的萃取和反萃取。（3）反胶团中微水相体积最多仅占有机相的几个百分点、所以它同时也是一个浓缩操作。特点：（1）萃取进入有机相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，从而避免了与有机溶剂相直接接触而引起的变性，失活。影响反胶团萃取生物分子的主要因素：（1）水相pH值的影响：表面活性剂的极性头朝向反胶团的内部，反胶团的内壁带电荷，而蛋白质是一种两性电解质，水相的pH值决定了蛋白质分子表面可电离基团的离子化程度，当蛋白质所带电荷与反胶团内所带电荷的性质相反时，由于静电引力，可使蛋白质转移到反胶团中。相反，当水相pH大于等电点时，由于静电斥力，使溶入反胶团的蛋白质反向萃取出来，实现了蛋白质的反萃取。（2）水相离子强度的影响a：离子强度影响到反胶团内壁的静电屏蔽的程度，降低了蛋白质分子和反胶团内壁的静电作用力。b：减小了表面活性剂极性头之间的相互斥力，使反胶团变小。这两方面的效应都会使蛋白质分子的溶解性下降，甚至使已溶解的蛋白质从反胶团中反萃取出来。（3）助表面活性剂的影响蛋白质的分子量往往很大，超过几万或几十万，使表面活性剂形成的反胶团的大小不足以包容大的蛋白质，而无法实现萃取，此时加入一些非离子表面活性剂，使它们插入反胶团结构中，就可以增大反胶团的尺寸，溶解较大相对分子质量的蛋白质。（4）溶剂体系的影响溶剂的性质，尤其是极性，对反胶团的形成和大小都有影响。常用的溶剂有：烷烃类（正己烷、环己烷、正辛烷、异辛烷等），有时也使用助溶剂，如醇类。可以调节溶剂体系的极性，改变反胶团的大小，增加蛋白质的溶解度。二、蛋白质的溶解蛋白质向非极性溶剂中反胶团的纳米级水池中的溶解，有图8.5所示的四种可能。（1）为水壳模型；（2）蛋白质中的亲脂部分直接与非极性溶剂的碳氢化合物相接触；（3）蛋白质被吸附在微胶团的“内壁”上；（4）蛋白质被几个微胶团所溶解，微胶团的非极性尾端与蛋白质的亲脂部分直接作用。三、反胶团萃取因分离中使用的表面活性剂种类不同，如阴离子型和阳离子型，其相互作用和分离原理也会不同。1、氨基酸的分离特性由于氨基酸因pH不同而发生正负电荷的变化和带有疏水性残基所以以静电和疏水性相互作用来定量评价氨基酸的萃取特性和效果。2、酶、蛋白质萃取特性以表8.2所示的酶、蛋白质为例，考察萃取或反萃取时静电性相互作用以及pH对这种作用的影响。这3个蛋白分子大小很接近，普通方法难以分离。①小分子蛋白质当pHpI时，蛋白质不能溶入胶团内，但在等电点附近，急速变为可溶。当pHpI时，即在蛋白质带正电荷的pH范围内，它们几乎完全溶入胶团内。pI10.6pI7.8pI11.1表面活性剂AOT时（极性头带负电荷）②、蛋白质分子量增大到一定程度，即使将pH向酸性一侧偏离pI，萃取率也会降低（即立体性相互作用效果增大）。③、分子量更大的BSA的场合下，全pH范围内几乎都不能萃取（即静电相互作用效果无限小，可忽略不计）。④、降低pH，正电荷量增加，萃取率急速减小。这被认为是蛋白质的pH变性所造成的。⑤添加KCl等无机盐，因离子强度的增加和静电屏蔽的作用，而使静电性相互作用变弱，一般地，萃取率下降无机盐浓度较大时，原来已进入反胶团的蛋白也会“反向溶出”。原因是：添加KCl等无机盐，对有机相具有脱水作用（W0减小），使立体性相互(排除)作用增大。（2）立体性相互作用反胶团粒径并非一致，存在一粒径分布。反胶团的粒径分布（分离场）随盐浓度和AOT浓度的增加而发生显著的变化。蛋白质溶入与否，对它几乎没有影响。动态光散射法测定•即使萃取溶入胶团的蛋白质的种类和分子量不同，分离场的特性（胶团平均直径和含水率）几乎不变。•随着蛋白质分子量的增加，分配系数KpI（蛋白质等电点处的分配系数）迅速下降。（3）其它的相互作用关于疏水性相互作用和特异性相互作用，还研究不多。一般认为疏水性相互作用对蛋白质分配特性的影响不大。第四节在分离工艺中的应用一、蛋白质分离/以含有核糖核酸酶-a、细胞色素C、溶菌酶的水溶液为例第一步：在pH=9时，核糖核酸酶-a带负电荷，即使在较低的盐浓度下也不能被反胶团萃取而留在水相中。细胞色素C和溶菌酶由于都带正电荷，被萃取到反胶团中。pI10.6pI7.8pI11.1第四节在分离工艺中的应用第二步：利用提高离子强度，将细胞色素C反萃到水相中，而溶菌酶仍留在反胶团中。第三步：进一步提高pH值和离子强度，将溶菌酶反萃到水相中。二、浓缩α-淀粉酶使用如图8.14所示，用2个混合槽和2个澄清槽组成连续萃取/反萃取流程，用TOMAC/0.1%(v)辛醇－异辛烷的反胶团体系循环萃取分离α-淀粉酶，控制第一级水相中酶浓度在较低水平上，使失活速度很小，将α-淀粉酶浓缩了8倍，酶活力损失约30%。对该过程优化，在反胶团中加入非表面活性剂，以提高分配系数，同时加大搅拌速度，以提高传质速率，反萃液中α-淀粉酶的活力回收率为85%，浓缩了17倍。TOMAC/0.1%(v)辛醇－异辛烷的反胶团体系三、直接提取胞内酶用反胶团萃取直接从全发酵液中提取和纯化棕色固氮菌的胞内脱氢酶：将全细胞的悬浮液注入CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）/己醇-辛烷反胶团溶液中，完整的细胞在表面活性剂的作用下，析出酶进入反胶团的“水池”中，经反萃取，可选择性地回收浓度很高的酶。该技术不利的一面是细胞碎片留在反胶团中，