HPLC高效液相色谱实验讲义

海南大学材料与化工学院周雪晴高效液相色谱法一.色谱法概述二.高效液相色谱法（原理、相关术语、分类）三.高效液相色谱仪（仪器结构与原理）四.色谱的定性定量分析五.奶粉中三聚氰胺测定实例六.液相色谱分析方法的开发工作原理用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号或进行数据处理而得到分析结果。样品组分分离示意图色谱术语：色谱图、保留时间、死时间、峰高、峰面积、峰宽、半峰宽、分辨率、柱效、塔板数色谱分析可以认为进入柱子内的样品成分在流动相中是呈“正态分布”的，我们可以根据tR（峰的位置〕来定性；根据峰面积或峰高（h）来定量。无保留物质HPLC系统构成数据采集处理系统自动进样器检测器溶剂输送系统储液瓶手动进样阀色谱柱废液瓶流动相供应系统进样系统1.归一化法(NormalizedPercent)2.外标法(ExternalStandard)3.内标法(InternalStandard)定量分析将试样中所有组分的含量之和按100％计算，以它们相应的色谱峰面积为定量参数。如果试样中所有组分均能流出色谱柱，并在检测器上都有响应信号，都能出现色谱峰，可用此法计算各待测组分X的含量。其计算公式如下：定量分析归一化法定量例：分析乙醇、庚烷、苯及乙酸乙酯的混合物。实验测得它们的色谱峰面积各为5.0、9.0、4.0、及7.0cm2，由手册查得它们的相对重量校正因子FＷ分别为0.64、0.70、0.78及0.79，按归一化法分别求它们的重量百分浓度。（1）乙醇%=（2）庚烷=%6.17%10015.1820.3%10079.00.778.00.470.00.964.00.564.00.5%7.34%10015.1870.00.9定量分析准确称量样品的重量为m克，取一纯物质（内标物）适量，加入其中，并准确称量内标物重量为ms克，混匀，进样。测量色谱图上需定量的i组份的峰面积Ａi及内标物的峰面积Ａs，则i组份在样品m中所含的重量mi，与内标物质的重量ms，有下述关系：。只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。定量分析内标法定量)()(smimisifAsfAmm%100%mmCii%100%mmfAsfACsmsmiii例：无水乙醇中的微量水的测定可按下述方法进行：样品配制准确量取被检无水乙醇10ml称重（净重）为79.3700g。用减重法加入无水甲醇约0.25g，精密称定为0.2572g，混匀待用。经色谱分析测得数据如下：水：h=4.60cm，甲醇：h=4.30cm计算：（1）重量百分含量：用以峰面积表示的相对重量校正因子；f甲醇=0.58计算：cmWh130.02cmWh187.0255.02OHf)/%(228.0%1003700.792572.058.0187.030.4065.155.0130.060.4065.1%2WWggcmcmcmcmOH定量分析比较相同分析条件下纯样（标准样品）与样品中该组份色谱峰面积或峰高，进行定量的分析方法称为外标法。也被称为定量进样校正曲线法，或定量进样法。此方法是在进样量、色谱仪器及操作等分析条件严格固定不变的情况下，先将不同含量的组份纯样等量进样，进行色谱分析，求得含量与色谱峰面积或峰高的关系，将此关系绘成定量校正曲线，而后在同样条件下分析待测样品，测量待测样品的峰高或计算峰面积，并以此在校正曲线上求出样品含量。外标法定量当被测样品中各组份浓度变化不大时，例如工厂中控制分析的样品，其组成一般变化不大，可以不必做校正曲线，用单点校正法来分析。即配制一个和被测组份含量十分接近的标准样，在同一条件下定量进样分析标准样及待测样品，由两者的峰高比或峰面积比计算未知样品含量。ssiiAmAm外标法定量五、奶粉中三聚氰胺测定实例奶类制品中的三聚氰胺􀂙伊利雪糕、四洲甜点、乐天蛋糕、大白兔奶糖、雀巢牛奶、立顿三合一奶茶、亨氏米粉、吉百利巧克力„„样品前处理过程及设备氮吹第六章液相色谱分析方法1、色谱柱的选择根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度等因素进行选择。①大多数药物可用C18反相（ODS）柱加以分离测定；②也可选用正相分配色谱柱（氨基柱、氰基柱）或硅胶吸附色谱柱等；③解离药物可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交换色谱分离测定；④脂溶性药物异构体的分离测定可采用硅胶吸附色谱柱。2、流动相的选择1）反相键合相色谱流动相常用溶剂适用范围部分含水溶剂甲醇-水、乙腈-水系统用于分离中等极性、弱极性药物非水溶剂乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氢呋喃等用于分离疏水性物质缓冲溶液三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液用于可溶于水并具可解离特性的化合物反相键合相色谱常用流动相2）正相键合相色谱①常采用饱和烷烃（如正已烷）中加入一种极性较大的溶剂作为极性调节剂（如异丙醚），通过调节极性调节剂的浓度改变溶剂强度；②常采用二元以上的混合溶剂系统。3、洗脱方式等度洗脱是在同一分析周期内流动相的组成保持恒定，使所有组分的k值都处于这个范围内，适用于组分数较少、性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成（如溶剂极性、离子强度和pH值等），适用于分析组分数多、性质相差较大的复杂混合物样品，从而使所有组分都在适宜条件下获得分离。4、检测器检测器特点最低检测限适用范围紫外检测器（UV或UVD）分为:①可变波长型②二极管阵列检测器①用于检测有外吸收的物质;②灵敏度较高,噪音低,线性范围宽,对流速和温度波动不灵敏,可用于梯度洗脱.10-7-10-12g用于芳烃、稠环芳烃、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羰基和羧基化合物等荧光检测器(FD)①用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质;②灵敏度高于紫外检测器1×10-10g/ml主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合化物及酶等蒸发光散射检测器(ELSD)①属通用型检测器,理论上可用于挥发性低于流动相的任何样品组分;②检测灵敏度较低,适用于流动相能挥发的色谱洗脱,不能用含缓冲盐的流动相用于检测糖、高分子子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体等几十类化合物4、检测器电化学检测器(ECD)用于能氧化、还原的有机物质的检测1×10-12g/ml适用生物胺、酚、羰基化合物、巯基化合物等示差折光检测器(RID)①属通用型检测器,利用组分与流动相折射率之差进行检测.②稳定性好,操作方便.③灵敏度低,受环境温度、流动相组成等波动的影响大,不适合梯度洗脱10-8g/ml尤其适合于糖类的检测化学发光检测器(CLD)①高选择性、高灵敏度的新型检测器.②设备简单,自身发光,无需光源,价格便宜Pg级(10-12)用于分析微量脂质、核酸、生物胺等5、HPLC前处理（1）流动相的处理①溶剂的纯化选择专供色谱分析用的“色谱纯”溶剂，分析纯或优级纯溶剂在很多情况下也可满足色谱分析的要求。由于不同的色谱柱和检测方法对溶剂的要求不同，有时需进行除去紫外杂质、脱水、重蒸等纯化操作。水一般采用石英系统二次蒸馏水。②流动相脱气HPLC所用的流动相必须预先除去其中的空气，习称脱气，一般在临用前对流动相进行脱气，常用的脱气法有•超声波振荡脱气、•惰性气体（He）鼓泡吹扫脱气、•抽真空•加热法。③过滤过滤是为了防止不溶物堵塞流路和色谱柱入口处的微孔垫片，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是过滤，采用0.45μm以下微孔滤膜过滤。滤膜分有机溶剂专用和水溶液专用两种。（2）样品的处理HPLC分析前需对样品进行预处理，以便将待测物质有效地从样品基质中释放出来，使样品的形式及所用溶剂符合HPLC的要求。①待测组分的提取根据样品成分及组分性质选择合适的提取方法和提取条件。②溶剂的挥发对于液体样品或经处理后得到的样品溶液，若待测物的浓度在定量限以上，且溶剂对HPLC系统没有干扰，可以直接进样分析。但很多情况下需除去溶剂，浓缩甚至干燥样品，除去溶剂的方法有：自然挥散或在氮气流下吹干，适用于小体积样品和挥发性溶剂；减压蒸发，适用于热不稳定样品；冷冻干燥，适用于受热易分解破坏的样品。③滤过样品溶液进样前，需用滤膜抽滤或针头滤器过滤，以有效除去样品溶液中的悬浮物或部分大分子杂质。其中液-液分配色谱是中药制剂分析中应用最广泛的方法，根据固定相与流动相的极性差别，分为正相色谱和反相色谱两类。正相色谱:流动相极性小于固定相极性的分配色谱法，主要用于极性物质的分离测定；反相色谱:流动相极性大于固定相极性的分配色谱法，主要用于非极性、中等极性物质的分离测定化学键合相是将固定液的官能团键合在载体上所形成的固定相。具有化学性能稳定，热稳定性好，一般在pH2-8范围的溶液中不变质，使用过程不流失，载样量大，适于梯度洗脱等特点，已广泛用于正相与反相色谱，离子抑制色谱，离子对色谱。药典中HPLC法所采用的固定相均为化学键合相。以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法.现就中药制剂分析中最常用的键合相色谱法作一介绍。（1）反相键合相色谱法反相键合相色谱法是现代液相色谱中应用最为广泛的方法，占整个HPLC应用的80%左右。反相色谱法一般采用非极性键合相，十八烷基键合相（简称ODS或C18）是最常用的非极性固定相，对于各种类型的化合物都有较强的适应能力；流动相通常以水为基础溶剂，再加入一定量能与水互溶的极性调整剂，常用的有甲醇-水、乙腈-水系统。极性调整剂的性质及其与水的混合比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响，流动相的极性增大，洗脱能力降低，溶质的k增大，tR增大；反之，k与tR减小。调整流动相的极性，可控制k值在所要求的范围内（k=1-10），对于结构类似的组分，极性大的组分先出柱。（2）正相键合相色谱法正相键合相色谱法的应用不如反相色谱法普及，主要用于分离分析溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。氰基（-CN）、氨基（-NH2）和二醇基（DIOL）键合相是正相色谱常用的极性键合相，流动相通常用烷烃（常用正已烷）加适量极性调整剂构成。（3）离子对色谱法直接将离子对试剂加入到流动相中，用以分离离子型或可离子化化合物的方法作为离子对色谱法（PIC或IPC），该法可分为正相离子对色谱法和反相离子对色谱法，但近年来广泛应用的几乎都是反相离子对色谱法，故本书只介绍反相离子对色谱法.①基本原理:以C18或C8键合相为固定相，用含离子对试剂的有机溶媒-水溶液为流动相，用以分离离子型或可离子化化合物.②适用范围:适用于有机酸、碱、盐的分离;用离子交换色谱法无法分离的离子和非离子混合物的分离;在中药制剂分析广泛用于生物碱、有机酸的分析。③缺点:离子对试剂价格比较贵.④分离条件的选择:离子对试剂的性质和浓度、流动相的pH值及流动相中所含有机溶剂的种类与比例等。i离子对试剂的选择通常所选用离子对试剂的电荷应与试样离子的电荷相反。离子对试剂主要应用对象1、季铵类（如四甲基、四丁基、十六烷基三甲基铵）强酸和弱酸（如磺酸染料、羧酸、磺胺类药物、水溶性维生素）2、叔胺类（如三辛基胺）磺酸盐等3、烷基磺酸盐（如戊烷、已烷、庚烷、辛烷、十二烷基磺酸盐）强碱和弱碱（如儿茶酚胺、罂粟碱、烟酰胺）4、高氯酸各种碱性物质（如有机胺、肽）5、烷基硫酸盐（如辛烷、十二烷基硫酸盐）应用对象同烷基磺酸盐反相离子对色谱法中流动相pH值的选择原则样品类型流动相PH值说明1、强酸（pKa2）如磺酸染料2-7.4在整个pH范围内，样品可离解，实际pH值的选择取决于共存的其它组分类型。2、弱酸（pKa2）如氨基酸、羧酸6-7.42-5样品可离解，其k值取决于离子对的性质样品的离解被抑制，其k值取决于未离解样品的性质。3、强碱（pKa8）如季铵类2-8同强酸4、弱碱（pKa8）如儿茶酚胺6-7.42-5样品的离解被抑制，其k值取决于未离解样品的性质样品可离解，其k值取决于离子对的性质。i