实验：植物体内游离脯氨酸含量的测定

实验：植物体内游离脯氨酸含量的测定植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。【原理】采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nM处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。【仪器与用具】分光光度计；水浴锅；漏斗；20ml大试管；20ml具塞刻度试管9支；5～10ml滴管。【试剂】1、3%磺基水杨酸水溶液：3g磺基水杨酸溶于100mL蒸馏水中2、甲苯3、2.5%酸性茚三酮显色液：将2.50g茚三酮于60mL冰醋酸和40mL6mol/L磷酸中，加热（70℃）溶解。（冰乙酸和6mol/L磷酸以3：2混合，作为溶剂配制，此液在4℃下2-3天有效）4、脯氨酸标准液：准确称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容到250ml，其浓度为100μg/mL。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/mL的脯氨酸标准液。【方法】1、标准曲线制作1）取7支具塞刻度试管按下表加入各试剂。混匀后在沸水中加热40min。管号（ml）0123456标准脯氨酸（ml）00.20.40.81.21.62.0蒸馏水（ml）21.81.61.20.80.40冰乙酸（ml）2222222酸性茚三酮显色液（ml）3333333脯氨酸含量（ug）02481216202）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管为对照在波长520nm下比色。3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。2、样品测定1）脯氨酸提取取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2～0.5g(干样根据水分含量酌减)，分别置于大试管中，加入5ml3％硝基水杨酸溶液，于沸水浴中浸提10min（提取过程中要经常摇动）。2）萃取取出试管冷却后，吸取上清液2ml于干净试管，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min。取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质，静置待分层后，用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。3）结果计算从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。脯氨酸[μg／g(干或鲜样)]＝（C×V/a）/W式中:C:提取液中脯氨酸浓度(μg)，由标准曲线求得；V:提取液总体积(ml)；A:测定时所吸取的体积(ml)；W:样品重(g)。【思考题】1、植物体内游离脯氨酸测定有何意义？2、当改变萃取剂时，比色应做哪些改变，如何选择最适波长，如何选择最佳萃取剂？