毕赤酵母从入门到提高

螺旋讲堂2010年第1期总第20期本文所涉及的技术要点主要来源于相关文献、网络和书籍，此外，一些操作中的技巧及经验等来自于本人及同学、朋友的总结，仅供大家参考，同时也请下载者不要传播尤其是以商业为目的的复制、传播等等；如有转载、传播请注明来源于“螺旋网”。若本文侵犯了您的版权或有任何不妥，请Email：[e-mail]告知。此外，由于学识、经验有限，本文难免会存在一些错误或缺陷，敬请不吝赐教，联系方式：[e-mail]同时因存在环境、试剂、仪器以及人为等原因，不能保证实验100%的成功，仅供参考。写在前面，因为酵母里用到了很多遗传学的命名方法，所以建议大家首先看一下这个资料，可以让大家理解一些不常见的符号及意义。下载地址如下：一、甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。目前通过毕赤酵母表达了很多种性质不同的蛋白，越来越多的实验室及公司开始搭建毕赤酵母表达系统的平台，相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越来越深入，会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。1.主要优点1)具有强有力的乙醇氧化酶(AlocholOxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；2)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；3)营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产；4)可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L以上；5)表达量高，许多蛋白可达到g/L以上水平；6)在P.pastoris中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；7)糖基化程度低，与S.cerevisiae相比，P.pastoris不产生过度的糖基化。P.pastoris表达的糖蛋白的糖链长度为8-14个甘露糖，而S.cerevisiae糖链中甘露糖多达50-150个；S.cerevisiae分泌的糖蛋白的核心寡聚糖具有|螺旋讲堂终端α-1，3糖苷连接，使分泌的糖蛋白的抗原性明显增强，而P.pastoris的糖基化位点与哺乳类细胞的相同，其所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。2.毕赤酵母常用的菌株类型2.1Mut+和Muts在毕赤酵母基因组中有2个醇氧化物酶编码基因，即AOX1基因和AOX2基因。菌株利用甲醇的速度主要是依靠AOX1基因表达的AOX1蛋白，其醇氧化物酶的活性非常高以至于在有AOX1酶蛋白存在的情况下可以忽略AOX2酶蛋白，这就是甲醇营养型毕赤酵母的两种表型Mut+和Muts产生的原理。当菌株基因组中既有AOX1基因，也有AOX2基因时，菌株的表型为Mut+该菌株有甲醇的培养基中仍可以正常生长。当菌株基因组中仅有AOX2基因时，菌株的表型为Muts，该菌株在有甲醇的培养基中生长缓慢。2.2菌株GS115、KM71和SMD1168的区别GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的酵母受体菌。GS115、KM71、SMD1168是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+。重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似，但SMD1168是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。KM71没有AOX1基因，本身就是Muts。因此转化后所有的转化子都是Muts，不必鉴定表型。3.毕赤酵母菌株的生长毕赤酵母适宜的生长温度是28至30度，温度超过32度对蛋白的表达是有害的，并可能导致细胞的死亡。关于毕赤酵母的生长速度:„在YPD培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h„Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的„存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时„存在甲醇的情况下，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时二、毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有HIS4基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载体经限制性内切线性化以后，可在AOX1或his4位点进行同源重组，从而产生HIS+重组子。单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的1-10%。1.基因插入AOX1或aox1::AGR4位点GS115的AOX1或KM71的aox1::AGR4位点可以与载体上AOX1位点（AOX1启动子，AOX1转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1或aox1::AGR4基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。因为插入的表达盒没有破坏原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115中为HIS+Mut+表型，在KM71中为HIS+Muts表型。=55-2-Helixnet.cn螺旋讲堂图1重组质粒插入3’AOX12.基因替换AOX1位点在his4菌株如GS115中，载体及基因组中AOX1启动子及3’AOX1区的双交换事件(取代)，结果AOX1编码区全部被取代，产生HIS＋Muts表型。以AOX1位点由基因替代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选出HIS＋转化子的Mut表型。基因取代的结果是缺失了AOX1位点（Muts），增加了含有pAOX1、目的基因、HIS4的表达盒。基因取代（双交换事件）不如基因插入（单交换事件）发生得多。图2AOX1位点的基因被取代3.基因插入His4位点GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，载体上HIS4基因与染色体上his4位点之间发生单交换事件，结果在his4位点插入一个或多个基因拷贝。由于基因组上AOX1或aox1::AGR4位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株相同。=55-3-Helixnet.cn螺旋讲堂图3质粒插入形成双拷贝HIS4/his4基因4.多拷贝插入尽管多拷贝事件自发发生的概率很低，但是通过在培养基中加入选择性标记，还是很容易在转化子中筛选到插入多拷贝的表达核的转化子。其插入示意图如下：三、毕赤酵母表达重组载体的构建1．表达载体的选择根据基因的表达定位及目的可以简单的将毕赤酵母的表达载体主要分为以下几类：(1)胞内表达载体主要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)，等。该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以避免毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不能被糖基化相关基因的表达。(2)分泌型表达载体主要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P等。由于毕赤酵母本身的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积累。常用的分泌的信号序列主要是由89个氨基酸组成的α=55-4-Helixnet.cn螺旋讲堂交配因子(α-factor)的引导。(3)多拷贝插入表达载体如pPIC9K，pPIC3.5K。在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表达量。该载体均可用于在体内（pPIC3.5K,pPIC9K）或体外（pAO815）产生并分离多拷贝插入，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。2．如果想要表达的重组蛋白具有天然的N端，应该将克隆的基因直接连接在Kex2蛋白酶的切点后Kex2蛋白酶切割的位置在信号肽序列中精氨酸和谷氨酸连接处：Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala“*”位置为Kex2蛋白酶切割位点。Ste13蛋白酶切割的位置在信号肽序列中谷氨酸和丙氨酸重复处：Glu-Ala*-Glu-Ala*“*”位置为Ste13蛋白酶切割位点。以pPICZα为例，想表达天然N端重组蛋白请使用XhoI切点并用PCR重建从XhoI（1184-1189）开始到编码精氨酸（1193-1195），以保证重组蛋白被有效切割。在成功表达重组蛋白以后需要对其进行N端测序来昀后确定其是否正确切割。四、几种酵母转化方法的比较1.线性化=55-5-Helixnet.cn螺旋讲堂酵母转化的第一步是做线性化，不同的酶可以产生不能的效果，常用的酶主要有以下四个，产生的表型如下：限制酶插入事件GS115表型KM71表型SalI或StuI插入his4His+Mut+His+MutsSacI插入5’AOX1His+Mut+His+MutsBglII取代AOX1His+MutsHis+Muts（不推荐）2.转化方法几种酵母转化方法的比较转化方法转化效率(perμg)方便因素多拷贝整合原生质体法105低可以电击转化105高可以PEG1000103高无LiCl102高无附英文原版以防我翻译的可能不准（PichiaProtocols28页）3.毕赤酵母的电击感受态的制备及电击转化(1)感受态的制备：a)挑取酵母受体菌的单菌落接种于10mLYPD培养基中，30℃摇床过夜。b)以1%接种量转接100mLYPD液体培养基，30℃摇床过夜至OD=1.3-1.5。c)4℃离心5000rpm,5min,弃上清。d)用100mL冰预冷无均水将菌体重悬。e)4℃离心5000rpm,10min,弃上清。f)用50mL冰预冷无均水将菌体重悬。g)4℃离心5000rpm,10min,弃上清。h)再用20mL1mol/L的山梨醇洗涤1次i)溶于200uL1mol/L的冰预冷的山梨醇，以备转化很多朋友问，感受态做好了可以在-80度放么?在这里我给出我自己的一点实验心得，酵母感受态尽量要现用现做，因为转化的效率有很大的影响，我现做的感受态的转化效率昀高阳性率约为20%左右，以前不是使用现做的感受态一般的阳性率在1%-2%。很多朋友说自己的阳性率比较低，可以考虑一下是不是感受态的问题。(2)毕赤酵母的转化在80μl酵母感受态细胞中加入用合适酶切位点线性化的质粒1-5μg冰上放置15分钟，迅速加入0.2cm电击杯中（冰预冷），电击，迅速加入山梨醇，涂板。感受态尽量现用现做，电击以后直接涂板，不需要活化。一般在MD上3-4天会长出肉眼可见的菌落，在RDB上需要4-5天可以长出肉眼可见的菌落。至此感受态及转化已经完成。在这里我要强调一下重组质粒的含量一定要在1-5μg，而且越高越好，越纯越好。我一般在酶切以后，将切好的基因片段用乙醇沉淀后溶于10μl待转化就好。线性化质粒的含量也对转化效率有很重要的影响，切记。很多找不到阳性重组子的朋友，可以考虑一下是不是这个问题。4.原生质体方法转化毕赤酵母(1)原生质体方法转化毕赤酵母原理=55-6-Helixnet.cn螺旋讲堂原生质细胞的解释：毕赤酵母细胞壁阻止摄入DNA