8.细菌GC含量测定

细菌GC含量测定方法一般概念定义染色体DNA中鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)占四种碱基总和的百分比；是细菌分类和鉴定的重要指标。意义细菌GC含量具有种特异性，且不受生长状态和培养条件的影响。概念GC含量在分类学上的意义目前已知的细菌GC含量在25～75％之间；一般认为：GC含量在种内差异≦3％；属内差异≦10％；GC含量主要用于排除不确切的分类单位，而不是用它去建立一个新的分类单元亲缘关系近的种，GC含量一定相近GC含量相近的种，亲缘关系不一定相近概念测定细菌GC含量的方法纸层析法浮力密度法热变性温度(Tm)法高压液相层析(HPLC)法纯DNA：OD260/OD280=1.8(＞1.9,表明有RNA污染;＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）•双链DNA---单链DNA的增色效应•GC含量和解链温度成正比双链DNA单链DNA原理E.coli的DNA变性温度曲线0.3240.3440.3640.3840.4040.4240.44463646566676869707172737475767778温度OD260nm基因组DNA变性温度曲线6Tm影响Tm值的因素热变性温度法（Tm法）方法提取、纯化基因组DNA－用0.1×SSC缓冲液调整DNA浓度－加热变性－读取数据－计算GC含量注意事项测试菌株和参比菌株同时处理，以消除误差DNA浓度一般在OD2600.2～0.5，不同菌株差别不要过大检测温度范围一般在65～95℃，升温速率为1℃/min原理9从Tm值计算GC含量实验室常用参比菌株为E.coliK12(GC含量为51.2％)1xSSC(0.15mol/LNaCl,0.015mol/L柠檬酸钠):G+Cmol%=51.2+2.44(Tmx-TmK12)0.1XSSC(0.015mol/LNaCl,0.0015mol/L柠檬酸钠):G+Cmol%=51.2+2.08(Tmx-TmK12)基因组DNA变性温度曲线基因组DNA变性温度曲线DNA纯度是试验成功与否的关键12GC含量测定--HPLC法原理碱基在240～290nm有强的吸收峰，DNA被降解后利用高压液相层析进行分离；用紫外分光光度计定量测定不同碱基的含量。优点所需DNA量小,重复性高。13方法DNA变性－S1核酸酶酶切－碱性磷酸酶处理－高压液相层析分离－计算峰面积－碱基含量可以检测碱基（酸水解）、核苷（酶解）和核苷酸（酶解）GC含量测定--HPLC法变性S1S1dsDNAssDNA流动相12％甲醇、20mM三乙胺-磷酸（pH5.1），0.22μm滤膜过滤、排气色谱条件C18反相柱、柱温37℃、检测波长254nm、流动相流速1.0ml/minGC含量测定--HPLC法注意事项选择λDNA（49.858％）作为参照使用商品化的试剂盒提取基因组DNA延长酶解反应时间以保证降解效果S1核酸酶:2h,37℃－4h,37℃CIP:6h,37℃－10h,37℃脱氧胞苷(dC)0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min-500-25002505007501000125015001750200022502500275030003250mAU254nm,4nm(1.00)脱氧鸟苷(dG)0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.013.014.0min-200-10001002003004005006007008009001000110012001300mAU254nm,4nm(1.00)LambdaDNA0.02.55.07.510.012.515.017.5min-30-20-100102030405060708090100110120130140150160170180190mAU254nm,4nm(1.00)dGdCdTdA测定结果0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.013.014.015.016.0min-2500250500750100012501500175020002250mAU254nm,4nm(1.00)dGdCdTdA0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.013.0min-5.0-2.50.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.5mAU254nm,4nm(1.00)测定结果彻底降解DNA是试验成功的关键谢谢细菌的DNA中，A和C经常是被修饰的；所以在测定GC含量时，G和T的比例更加有用。