实验5-1--大黄中蒽醌的提取分离与鉴定

实验5大黄中蒽醌的提取分离与鉴定实验目的：掌握缓冲纸色谱的基本操作技术，能根据缓冲纸色谱结果，设计液液萃取法分离混合物的实验方案；掌握pH梯度萃取法的原理及操作技术；熟悉缓冲液的配制方法、如何选择萃取剂及其用量；了解蒽醌类化合物的鉴定方法。实验原理：大黄为泻下、清热解毒、活血化瘀中药，有“推陈致新”的作用。品种繁多，质优者为蓼科植物掌叶大黄（RheumPalmatumL.）。药用大黄（RheumofficinaleBaill）和唐古特大黄（R·tanguticumMaximexReg）的根。大黄中具有泻下作用的成分是几种蒽醌衍生物，其中甙是主要的成分，因其泻下作用常强于相应的甙元，甙元主要包括大黄酚、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素和大黄素甲醚共五种蒽醌甙元。大黄的致泻效力与其中的结合性大黄酸含量成正比。游离的蒽醌甙元几无致泻作用。具有较强的致泻作用的蒽醌甙有以下几种：大黄酚-1-葡萄糖甙、大黄素-6-葡萄糖甙、芦荟大黄素-8-葡萄糖甙、大黄酸-8-葡萄糖甙、大黄素甲醚葡萄糖甙、还含有蒽醌衍生物的双糖甙，如：大黄素双葡萄糖甙、芦荟大黄素双葡萄糖甙、大黄酚双葡萄糖甙以及番泻甙A和B，番泻甙C，番泻甙的泻下作用，较蒽醌甙为强，但含量远较后者为少。近年来，日本人西冈五夫从大黄中分离出四种新的大黄泻下成分，称大黄酸甙A、B、C、D。除此外还含有大黄鞣酸及相关物质。如：没食子酸（一部分是游离的，一部分是结合成没食子酰葡萄糖甙），儿茶精，此类鞣质及相关物质有止泻作用与蒽醌衍生物的甙类之泻下作用恰恰相反。1、大黄酚（chrysopanol）金黄色片状结晶。Mp196℃（乙醇或苯），能升华，可溶于丙酮、醋酸、氯仿、甲醇、乙醇、热苯，微溶于石油醚、乙醚，不溶于水，NaHCO3和Na2CO3水溶液，可溶于NaOH溶液。2、大黄素（Emodin）橙黄色针状结晶，mp256～257℃（乙醇或冰醋酸）能升华，其溶解度：乙醚0.14%，苯0.041%,氯仿0.0718%，几不溶于水，易溶于乙醇，可溶于稀氨水，Na2CO3水溶液。大黄素具有抑制小鼠黑色瘤和小鼠乳腺瘤的作用。3、芦荟大黄素（Aloeemodin）黄色针状结晶，mp223～224℃（甲苯）能升华，可溶于乙醚、苯、热乙醇、稀氨水、Na2CO3和NaOH水溶液。4、大黄酸（Rhein）黄色针状结晶，mp321～322℃（升华）。不溶于水，能溶于吡啶、碳酸氢钠水溶液，微溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚、石油醚。大黄酸对艾氏腹水癌有抑制作用。5、大黄素甲醚（Physcion）红色针晶mp206℃（苯）能升华。溶解性能似大黄酚。6、羟基蒽醌甙类①大黄素甲醚葡萄糖甙（Physcionmonoglucoside）黄色针晶mp235℃②芦荟大黄素葡萄糖甙（Aloe-emodinmonoglucoside）mp239℃③大黄素葡萄糖甙（Emodinmonoglucoside）mp190～191℃浅黄色针晶④大黄酸葡萄糖甙（Rheinmonoglucoside）mp266～270℃⑤大黄酚葡萄糖甙（Chrysophanolmonolucoside）mp245～246℃⑥大黄素-l-O-β-D-葡萄糖甙（1-0-β-D-glucopyranosylemodin）mp239～241℃⑦芦荟大黄素-W-O-β-D-葡萄糖甙（W-O-β-D-glucopyranosylaloe-emodin）mp187～189℃⑧大黄酸甙A、B、C、D大黄酸甙A：R=OH大黄酸甙B：R=OH大黄酸甙C：R=H大黄酸甙D：R=H本实验根据大黄中的蒽醌苷类在酸性条件下加热，可水解成游离羟基蒽醌和糖，而游离羟基蒽醌不溶于水，可溶于乙醚、氯仿等亲脂性有机溶剂的性质，从水解物中将游离羟基蒽醌提出，再利用游离羟基蒽醌的酸性不同，采用pH梯度萃取法将其分离。也可利用游离蒽醌的极性不同，采用硅胶柱色谱方法进行分离。仪器、材料及试剂仪器：500mL圆底烧瓶、烧杯、滴管、橡皮管、球形冷凝管（30cm）层析缸、标本瓶、索氏提取器一套、250mL分液漏斗、布氏漏斗、抽滤瓶、普通滤纸、薄层板、喷雾器、广泛PH试纸。材料及试剂：大黄10～20g、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、硫酸、氨水、盐酸、乙醚、石油醚、醋酸乙酯。实验步骤1.游离蒽醌的提取称取大黄粗粉50g，加20%H2SO4水溶液150mL，在水浴上加热3-4小时，放冷，抽滤，滤饼水洗至近中性，抽滤，于70℃干燥后，研碎，置索氏提取器中，加入乙醚150mL回流提取3-4小时，得到乙醚提取液。乙醚提取液经薄层层析检查有大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚。薄层板为硅胶—CNC粘合板，展开剂为石油醚（60～90℃）：乙酸乙酯（7：3）近水平或直立展开，在可见光下，可看到四个斑点。其中Rf=0.9的黄色斑点为大黄酚和大黄素甲醚的混合物,在此条件下,不能分开,其余3个斑点依Rf值（由大到小）的顺序是大黄素（橙色斑点）、芦荟大黄素（黄色斑点）、大黄酸（黄色斑点）。2.PH梯度萃取分离（1）将乙醚提取液加入250mL分液漏斗中，以40mL2.5%NaHCO3水溶液萃取三次，乙醚层经薄层层析检查（薄层层析条件司上），提示乙醚提取液提出大黄酸后，合并三次NaHCO3萃取液，用浓盐酸酸化，可得大黄酸沉淀。（注意：加酸时应缓慢加入，以防酸液溢出）（2）经2.5%NaHCO3水溶液萃取后的乙醚层，继以2.5%NaHCO3水溶液萃取三次，每次40mL，用薄层层析法检查乙醚层，结果说明已提尽大黄素后，合并三次Na2CO3萃取液，并酸化，得大黄素沉淀。（酸化时注意操作同前）经2.5%Na2CO3水溶液提取后的乙醚液，再以2.5%Na2CO3水溶液提取约四次，每次30mL，经薄层检查，指示提尽芦荟大黄素，合并四次萃取液，酸化得芦荟大黄素沉淀。（酸化时操作注意同前）（3）经2.5%Na2CO3水溶液萃取过后乙醚层以2.5%NaOH水溶液萃取至碱水层无色为止（约四次），每次50mL，合并NaOH萃取液，酸化得沉淀。过滤、水洗至洗出液呈中性。低温干燥后溶于小体积石油醚中，作为柱层析的样品溶液，用簿层层性析检查样品溶液有一个黄色斑点（为大黄酚和大黄素甲醚混合物的斑点），若改用下述纸层析条件可将两者分开。纸层析条件：新华滤纸7×20（cm）展开剂：水饱和的石油醚（BP60～90℃）展开方式：上行法显色剂：4%NaOH乙醇溶液3.用纤维素粉柱层析法分离大黄酚和大黄素甲醚。（1）纤维素粉的制备：将新华滤纸（或其边角纸屑）剪成小片，称取15g，加入稀硝酸（每100mL水中加65～68%的硝酸5mL）300mL，加热水解（约2小时），抽滤（G3号耐酸漏斗），滤饼用蒸馏水洗至中性，再加少量乙醇、乙醚依次各洗涤一次，待挥发掉残存的乙醚后，低温烘干，粉碎，过120目筛备用。（2）装柱：将纤维素粉约8g，用水泡和石油醚（BP60～90℃）按湿法装柱。（3）样品上柱：将样品溶液用移液管小心加入层析柱柱床顶端。（4）洗脱：用水泡和石油醚（BP60～90℃）洗脱，分段收集，每份10mL，分别浓缩，经纸层析检查（纸层析条件同上），相同者合并，分别收集大黄酚和大黄素甲醚。大黄酚用醋酸乙酯重结晶后测熔点。4.大黄酚的鉴定（1）在薄层板上用点滴反应检查大黄酚对NaOH，MgAc2试液的反应。（2）测定大黄酚的紫外光谱。（3）用溴化钾压片法，测定大黄酚的红外光谱。思考题1.简述大黄中5种游离羟基蒽醌化合物的酸性与结构的关系。2.pH梯度萃取法的原理是什么？如何利用该方法分离大黄中的5种游离羟基蒽醌化合物？参考文献⑴吴剑锋主编，天然药物化学，北京：人民卫生出版社，2004