UPLC-BEH-amide柱使用说明

©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL1启用启用启用启用启用启用启用启用ACQUITYUPLCBEHAmideACQUITYUPLCBEHAmide色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱
操作条件要求操作条件要求操作条件要求操作条件要求：：：：—ACQUITYUPLCBEHAmide色谱柱可以在HILIC条件下使用，pH使用范围为2-11，可以在90℃范围内使用—同其它任何色谱柱一样，在极端pH、压力以及高温条件下使用将缩短色谱柱寿命
色谱柱平衡色谱柱平衡色谱柱平衡色谱柱平衡：：：：—拿到新的色谱柱，请首先用50倍柱体积的60/40乙腈/水（或起始流动相条件）冲洗色谱柱（以100-2.1mm的色谱柱为例，柱体积为0.4mL，50倍柱体积相当于20mL，如果使用0.4mL/min的流速，需要50分钟）；—开始进样前，用20倍柱体积的起始流动相平衡后再进样—如果使用梯度条件，在每次进样前都需要用8~10倍柱体积的起始流动相进行平衡（（以100-2.1mm的色谱柱为例，柱体积为0.4mL，8倍柱体积相当于3.2mL，如果使用0.4mL/min的流速，需要8分钟））—没有充分平衡的色谱柱将可能会出现保留时间的波动©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL2使用使用使用使用使用使用使用使用ACQUITYUPLCBEHAmideACQUITYUPLCBEHAmide色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱
流动相要求流动相要求流动相要求流动相要求：：：：—总是经常保持至少5％的极性溶剂在流动相体系中或梯度流动相中（如5％水，5％甲醇或2％水＋3％甲醇等），这将保证HILIC色谱填料始终处于水化润湿状态—在流动相体系中至少需要保证含有40％的有机溶剂（如乙腈）—当水相比例超过60%时，需要根据压力情况适当降低流速。所有涉及到水相流动相体系均应注意—尽量避免使用磷酸盐体系的流动相（磷酸盐缓冲液可能会在HILIC流动相体系中析出），但可以使用磷酸©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL3使用使用使用使用使用使用使用使用ACQUITYUPLCBEHAmideACQUITYUPLCBEHAmide色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱
进样溶液的要求进样溶液的要求进样溶液的要求进样溶液的要求：：：：—如果可能，进样溶剂应该尽可能地接近流动相的组成（等度条件）或者是梯度条件的起始流动相组成；除非您的系统配置了正己烷/四氢呋喃组件包（订货号：205000464），否则不能使用丙酮溶解样品—通用的进样溶液是75/25乙腈/甲醇，使用此条件可以获得较好的样品溶解度和色谱峰形；当待分析的糖在有机溶剂中溶解度比较差时，使用较高浓度的水相溶液也是可以接受的，通常50/50的乙腈/水可以提供较好的结果—进样溶液对峰形的影响需要通过实验确定，有时候用水或者高比例水相溶解样品，不一定对峰形有特别大的影响，具体情况可以通过实验确证©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL4使用使用使用使用使用使用使用使用ACQUITYUPLCBEHAmideACQUITYUPLCBEHAmide色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱
其它需要注意的问题其它需要注意的问题其它需要注意的问题其它需要注意的问题：：：：—第一次使用ACQUITYUPLCTMBEHAmide色谱柱开发方法，摸索条件建议使用一个梯度条件（从95％乙腈至50％乙腈的梯度）；如果没有保留，则用95：3：2的乙腈：甲醇：水相缓冲液进行等度分析—将流动相中的水换成甲醇、丙酮或异丙醇也能提高保留—请确保进样针清洗的弱洗针液/Purge溶液是起始流动相（如高比例有机溶剂），否则峰形将变差。通常的洗针条件：o强洗：20/80乙腈/水800μLo弱洗：75/25乙腈/水500μL—除非配置了正己烷/四氢呋喃组件包（订货号：205000464），否则不能使用丙酮溶解样品—建议使用VanGuard保护柱以延长柱寿命©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL5使用使用使用使用使用使用使用使用ACQUITYUPLCBEHAmideACQUITYUPLCBEHAmide色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀
如果被分析的糖类化合物不包含还原糖，请按照“启用ACQUITYUPLCBEHAmide色谱柱”的说明进行操作；对于还原糖，需要按照如下进行分析。OHOOHHHHHOHOHOHHOHOHOHOHOHOHOHHOOHOOHOHHHHHHOHOHOHαααα-D-GlucoseOHOHHHHHOHOHOHOHββββ-D-Glucose变变变变现现现现还原糖会发生变旋现象，产生α-型和β-型端基差向异构体；高温以及高pH条件能够使两种差向异构体变成一个峰，如下两种条件均可：1.35℃，0.2%三乙胺或者0.1%氨水2.大于80℃，0.05%三乙胺还原糖会发生变旋现象，产生α-型和β-型端基差向异构体；高温以及高pH条件能够使两种差向异构体变成一个峰，如下两种条件均可：1.35℃，0.2%三乙胺或者0.1%氨水2.大于80℃，0.05%三乙胺©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL6DemonstrationofAnomerCollapseDemonstrationofAnomerCollapse1)Fructose,2)Glucose,3)Sucrose,4)Maltose,5)Lactose(each1mg/mL)2.1x150mmColumn@0.29mL/min123451234575%ACNwith0.2%TEAat35°°°°C80%Acetonewith0.05%TEAat90°°°°C132αααα4αααα2ββββ4ββββ5ββββMinutes0.01.02.03.04.05.06.07.08.05αααα75%ACNwithnomodifierat35°°°°Cαααα-D-glucopyranoseββββ-D-glucopyranoseOHOHHHHHOHOHOHOHOOHOHHHHHHOHOHOH©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL7使用使用使用使用使用使用使用使用ACQUITYUPLCBEHAmideACQUITYUPLCBEHAmide色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀
当分析还原糖时（如果糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、甘油醛等），请按照以下建议操作，否则会产生分叉峰。—使用较低的流速（2.1-50mm的色谱柱使用0.10~0.13mL/min流速）—对于较长的柱子如2.1-100mm，可以使用较高的流速如0.3mL/min；(说明：最佳流速需要通过实验确定)—在流动相A和B中分别加入三乙胺或氨水—复杂样品建议使用梯度条件—如果流动相使用丙酮，请不要使用丙酮溶解样品或者使用丙酮作洗针液。o通用的进样溶液是75/25乙腈/甲醇，使用此条件可以获得较好的样品溶解度和色谱峰形；当待分析的糖在有机溶剂中溶解度比较差时，使用较高浓度的水相溶液也是可以接受的，通常50/50的乙腈/水可以提供较好的结果；o洗针条件可按如下设置：强洗：20/80乙腈/水800μL；弱洗：75/25乙腈/水500μL©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL8使用使用使用使用使用使用使用使用ACQUITYUPLCBEHAmideACQUITYUPLCBEHAmide色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀—对于用UPLC/ELSD分析单糖和二糖，典型的等度条件如下：o含0.2%三乙胺的75%乙腈/水做流动相,35℃,流速:0.13mL/min2.1-50mmBEHAmide色谱柱o含0.05%三乙胺的77%丙酮/水做流动相,85℃,流速:0.15mL/min2.1-50mmBEHAmide色谱柱o含0.2%三乙胺的75%乙腈/水做流动相,35℃,流速:0.2mL/min2.1-100mmBEHAmide色谱柱—对于用UPLC/ELSD分析复杂多糖混合物，典型的梯度条件如下(分别在流动相A和B中加入三乙胺)：o10分钟内乙腈比例由80%变化至50%，流动相中含0.2%的三乙胺,35℃,流速:0.13mL/min2.1-100mmBEHAmide色谱柱；或者使用同样的梯度表，0.3mL/min2.1-150mmBEHAmide色谱柱；o10分钟内丙酮比例由80%变化至55%，流动相中含0.05%的三乙胺,85℃,流速:0.15mL/min2.1-100mmBEHAmide色谱柱©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL9使用使用使用使用使用使用使用使用ACQUITYUPLCBEHAmideACQUITYUPLCBEHAmide色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀—对于用UPLC/MS分析复杂单糖和二糖，典型的等度条件如下：o含0.1%氨水的75%乙腈水溶液，35℃,流速:0.13mL/min2.1-50mmBEHAmide色谱柱；—于用UPLC/MS分析复杂多糖混合物，典型的梯度条件如下(分别在流动相A和B中加入氨水)：o10分钟内乙腈比例由75%变化至45%，流动相中含0.1%的氨水；35℃，流速0.2mL/min，2.1-100mmBEHAmide色谱柱©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL10使用使用使用使用使用使用使用使用ACQUITYUPLCBEHAmideACQUITYUPLCBEHAmide色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀分析糖类化合物的秘诀—样品前处理方法：o液体样品：液体样品通常先用50/50乙腈/水稀释，再用0.22um针筒式滤膜过滤后进行分析o固体样品•称取约3g固体样品于50mL离心管中•加入25mL50/50乙腈/水，匀浆•在3200rpm离心30分钟•收集上清液，经0.22um针筒式滤膜过滤后进行分析o根据样品性质以及待分析物的浓度决定是否进行进一步稀释o对于基质非常复杂或者待分析物浓度很低的样品，需要使用如SPE等富集策略进行处理—建议使用VanGuard保护柱以延长柱寿命