液相色谱分析方法的建立

1吴园生WatersAsiaHeadquarter如何快速建立稳定可靠的液相色谱分析方法©2005WatersCorporation纲要•何谓理想HPLC色谱柱?•现代液相柱的选择技巧•系统、快速液相色谱方法开发策略•色谱柱生产流程对分离重现性的影响•总结2©2005WatersCorporation理想液相色谱柱的衡量标准•峰形佳、柱效好–对任何分析物(酸性,碱性和中性)•柱寿命长–不同pH和柱温下均有良好表现•色谱分离可轻易放大–从分析规模直接放大至制备规模•分离表现高度重现–柱与柱间、不同批次填料间和不同粒径填料间均需如此•柱产品质量的可溯源性和柱生产流程是否符合昀新GMP规范•价格适中©2005WatersCorporation为何峰对称性是理想色谱柱的首要判据?ƒ峰形不佳将导致¾方法开发难度加大、过程拖长¾分析结果不一致¾色谱分离度不足¾检测灵敏度降低3©2005WatersCorporationMinutes0510152025峰形不佳的后果ƒ积分不准ƒ分离度降低ƒ灵敏度不足©2005WatersCorporation99.6%99.8%99.9%积分后定量结果拖尾因子=1.0092.3%95.3%积分后定量结果97.8%拖尾因子=1.58峰形不佳对积分准确度的影响4©2005WatersCorporationRs=(trPeak2–trPeak1)/0.5(w4.4%Peak1+w4.4%Peak2)Rs=(11.5-10.6)/0.5(2.0+0.5)Rs=0.72Minutes0510152025注:基线分离需Rs不小于1.5峰形不佳对峰分离度的不良影响©2005WatersCorporation峰形不佳对检测灵敏度的影响:Tamoxifen(它莫西芬)0.00000.0004AU510Minutes510Minutes0.00000.0004AUC18品牌AC18品牌B注:对信噪比的要求LOQ（昀低定量限）10LOD（昀低检测限2信噪比A11.0B6.55©2005WatersCorporation纲要•何谓理想HPLC色谱柱?•现代液相柱的选择技巧•系统、快速液相色谱方法开发策略•色谱柱生产流程对分离重现性的影响•总结©2005WatersCorporation以传统方式制造硅胶色谱填料的过程:起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱）Na2SiO3(矿物)+2H+Si(OH)4(silicicacid)+2Na+硅胶颗粒(含金属杂质!)C18/C8bonding+endcappingC18/C8ReversedPhases(昀终仍带金属杂质!)6©2005WatersCorporation硅胶晶格中杂质铝对硅醇基酸度的影响质子酸HOSiOAlOOSiSiOHHOOOOOSiSi金属嵌入硅胶晶格中，使硅醇基的酸性大大增强+_©2005WatersCorporation硅胶中金属杂质含量对螯合性化合物Hinokitiol峰形的影响Minutes2468流动相:20mMPhosphateBufferpH3.6（含0.05%EDTA):Acetonitrile(50:50)低金属杂质高金属杂质含量OOMn+OOSiSi7©2005WatersCorporation传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响Minutes515253545AmitriptylineAcenaphthenePropranololandButylparabenNaphthalene铝杂质含量~375ppmTfUSP=6.5流动相pH7©2005WatersCorporation与键合相的疏水性作用双重保留机理:1).与键合相的的疏水性作用;2).与残余硅醇基间的离子交换作用O-SiO-SiO-O-SiO-SiO-O-SiO-O-SiO-SiO-SiO-O--SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+当流动相pH值小于3时,硅醇基趋于中性(未解离)BaseBase对碱性化合物的保留及严重拖尾两实验使用相同的传统C8硅胶柱离子交换作用碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理当流动相为pH6-8时,硅醇基带负电性(大部解离)8©2005WatersCorporation既然pH3时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情况下采用酸性条件进行分离?低pH可导致分离选择性的完全丧失!AU0.000.020.04Minutes0.002.004.006.008.0010.00AU0.000.010.020.030.04Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.00pH7.0pH2.0amitriptylinenortriptyline©2005WatersCorporation金属杂质的存在可使得硅醇基过度活化，以至某些碱性化合物在酸性条件下仍呈现拖尾峰分析物:Chlorpheniramine杂质铝含量,ppm12340100200300400拖尾因子“高纯硅胶”区流动相流动相:乙腈/KH2PO4pH3.0(20:80)9©2005WatersCorporation如何解决碱性化合物和螯合物的峰形问题?•从修饰流动相着手改善峰形(例如使用竞争性碱TEA或离子对色谱)–1970-1980年代策略•从改善反相填料着手降低硅醇基活性–自1990年代起至今©2005WatersCorporationWaters现代色谱柱三大技术平台亲水性化合物专用柱–Atlantis™dC18–Atlantis™HILIC柱杂化颗粒柱–XTerra®MSC18/C8–XTerra®RP18/RP8超纯硅胶柱–Symmetry®C18/C8–SymmetryShield®RP18/RP810©2005WatersCorporationTetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)Symmetry®系列超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成过程无金属杂质的超纯起始原料©2005WatersCorporation常见品牌C18柱在pH7下的性能比较品牌Acenaphk'Amitrip/AcenapαAmitriptyline拖尾因子(美国药典法)SymmetryC18161.31.9InertsilODS-2161.42.5PuresilC18141.53.3ZorbaxRxC18161.86.0PurospherRP-18164.86.0KromasilC18AlltimaC1819231.53.59.413Nova-PakC18162.35.5NucleosilC18154.310HypersilODS112.810ZorbaxODS21无法测得结果!11©2005WatersCorporation常见品牌C8柱在pH7下的性能比较品牌Acenaphk'Amitrip/AcenapαAmitriptyline拖尾因子(美国药典法)SymmetryC87.81.71.6LichrosphereselectB5.93.72.2InertsilC87.61.82.3YMCbasic3.72.12.8PuresilC87.52.12.9ZorbaxRxC85.56.76.0KromasilC88.22.16.9AltimaC86.14.47.0©2005WatersCorporation在pH3下的柱性能测试条件流动相:50mMpH3.00KH2PO4/H3PO4:ACN(80:20v/v)NClONH2+OHO-OHOOONH2NH+Chlorpheniramine(有机强碱,pKa9.1)Propranolol(有机强碱,pKa9.6)Maleate(有机强酸,pKa11.8,pKa26.1)Toluamide(中性物质)12©2005WatersCorporation2.6常见品牌C18柱在pH3下的性能比较柱品牌Toluamidek'Chlorph/ToluamαChlorpheniramineSymmetryC181.43.41.3PurospherRP-181.40.711.4AlltimaC182.43.21.8InertsilODS-21.72.91.9ZorbaxRxC181.43.32.0PuresilC181.63.62.9Nova-PakC181.33.9NucleosilC181.84.23.9ZorbaxODS1.74.94.6HypersilODS1.51111KromasilC181.53.61.8拖尾因子(美国药典法)©2005WatersCorporation柱品牌Toluamidek'Chlorph/ToluamαChlorpheniramine拖尾因子(美国药典法)SymmetryC81.42.21.2AlltimaC82.02.91.2InertsilC81.42.61.3PuresilC81.53.01.4ZorbaxRxC81.52.51.6YMCBasic1.03.81.8LiChrospherRP-selectB1.72.91.9kromasilC81.83.41.6常见品牌C8柱在pH3下的性能比较13©2005WatersCorporation对碱性化合物的峰对称性pH7pH3SymmetrySymmetry(极佳)InertsilPurospherLiChrospherRP-selectBAlltimaYMCbasicInertsilPuresilkromasilPurospherYMCbasicZorbaxRxZorbaxRxNova-PakLiChrospherRP-selectBkromasilPuresilAlltimaNova-PakNucleosilNucleosilHypersilZorbaxZorbaxHypersil(差)常见品牌柱在pH3和pH7下的峰形优劣排序©2005WatersCorporation用液相色铺柱全行业昀严苛的流程进行生产与测试14©2005WatersCorporation无与伦比的色铺柱批间分离重现性©2005WatersCorporationRepeatabilityandReproducibilityofRetentionDataandBandProfilesonReversed-PhaseLiquidChromatographicColumns:ResultsObtainedwithSymmetryC18ColumnsJournalofChromatographyA,830(1999)55-79MariannaKele(田纳西大学)&GeorgesGuiochon(橡树岭国家实验室)“…当Symmetry®C18同批号柱与柱间保留时间差异在0.1%之内、不同批号间柱间的差异在1%之内时，继续要求更精准的保留时间无异于苛求。”“…要在以上色谱柱上达致更优异的色谱保留重现性，很可能需要从所使用的仪器硬件本身着手进行系统优化。”无与伦比的色铺柱批间分离重现性来自色谱科学家的研究结论15©2005WatersCorporation杰出的柱床稳定与保护柱同时使用,可达致10,000次的进样次数©2005WatersCorporationWaters现代色谱柱三大技术平台亲水性化合物专用柱–Atlantis™dC18–Atlantis™HILIC柱杂化颗粒柱–XTerra®MSC18/C8–XTerra®RP18/RP8超纯硅胶柱–Symmetry®C18/C8–SymmetryShield®RP18/RP816©2005WatersCorporationAtlantis®dC18柱的成功秘诀表面峰端键合密度键合相连接方式微孔大小防微孔脱水峰形保留性能柱寿命©2005WatersCorporationAtlantis®dC18柱对极性化合物的优异保留性能对嘌呤碱表现良好峰形(因对填料进行了彻底封端)Compou