液相色谱柱各种维护方法

试剂部分2液相液相色谱柱的选择2.2填料种类分子量小于2000水溶性样品非离子型反相色谱CNWAthenaC18.C18-wp，C8，C4离子型反相色谱CNWAthenaC18.C18-wp，C8，C4离子交换色谱CNWAthenaSAX,SCX；TransgenomicICSepAN,ICSepCN氨基酸反相色谱CNWAthenaC18离子交换色谱TransgenomicAMINOSep氨基酸柱有机酸离子排阻色谱TransgenomicICSep系列有机酸柱；ShodexSUGAR　SH1821，KC-811单糖，二糖，寡糖反相色谱CNWAthenaNH2离子排阻色谱ShodexSUGAR　SH1821配体交换色谱TransgenomicCARBOSep树脂型糖柱多肽反相色谱CNWAthenaC18油溶性样品非极性反相色谱CNWAthenaC18正相色谱CNWAthenaNH2，CN，SIL极性正相色谱CNWAthenaNH2，CN，SIL手性样品手性色谱RegisWhelk-O，RegisPack，RegisCell分子量大于2000水溶性样品非离子反相色谱CNWAthenaC18-BIO蛋白质，多肽凝胶过滤色谱(GFC）Shodex　KW-800，SB-800HQ；CNWGel　X系列离子交换色谱AthenaSAX，SCX；CNWSep系列反相色谱CNWAthenaC18-BIO亲和色谱Shodex　AFpak核酸离子交换色谱AthenaSAX，SCX；CNWSep系列多糖凝胶过滤色谱(GFC)Shodex　KW-800，SB-800HQ；CNWGel　X系列离子交换色谱AthenaSAX，SCX；CNWSep系列油溶性样品凝胶渗透色谱(GPC)Shodex　SB-800HQ；CNWGel　S系列反相色谱CNWAthenaC18-BIO1.柱管的选择:液相色谱柱的柱管有SS316(不锈钢)、聚四氟乙烯、有机玻璃等材质，主要根据所使用的流动相特性，柱耐压程度及样品而定。对于有机溶剂，使用压力在5-30Mpa之间，一般使用SS316，对于压力低于4Mpa的，使用水或盐溶液作流动相时，使用有机玻璃或聚四氟乙烯较好，特别是对于有生物活性的样品，其活性损失较少。1.1内径A、1-2mm的色谱柱，是用于微型液相色谱MLC等特定场合，如液相-质谱联用。而对于常规分析，不大好用。虽然使用溶剂少，但对仪器要求很严格，要求死体积很小，另外色谱柱寿命较短。B、4-6mm(3.9,4.0,4.6,5.0,6.0mm)这些内径的色谱柱均是分析型的，对于常规分析很适用。特别是内径4.6mm的柱子是最常用的。其最佳使用流速为1ml/min，一般仪器均能匹配。柱效高、性能稳定、使用寿命较长。C、7.8-10.0mm的柱子是半制备柱，分析条件可以移植分析柱的，普通液相色谱仪均可使用，可以得到少量纯度很高的组分，用于组分的定性及一些研究工作，是一种很实用的工具。D、20-100mm的柱子是制备型液相柱，可制备大量的纯品组分，具有商业价值。目前，虽然价格较高，对于制药行业来讲，是必有的装备之一。1.2柱管长度从50-500mm，小于100mm的短柱称为快速柱，对组分简单、分析周期短的工作是一个比较合理的选择，但其抗污染能力较差，寿命较短；150-250mm最为常见，对一般分析己经足够了；对长于250mm的柱子柱效高，但柱压较高，单纯为了增加柱效而加长，也是不合算的。2.填料的选择2.1填料粒度常用的填料颗粒度在3--10um之间，使用小粒径填料柱效高，但柱压也高，特别是使用含水量较大的甲醇流动相，由于水与甲醇之间形成氢键反应，粘度增大，柱压是不可忽视的因素，柱压高，很容易产生柱床层塌陷，降低柱子的使用寿命。如要追求高柱效，要用5um填料柱，推荐使用水一乙腈体系。对于制备色谱柱，主要是追求制备量，而分离是次要的。一般选择粒径大于10um，廉价，且柱压小。对于UHPLC，填料粒径较小，压力也较HPLC高很多，如CNW的AthenaUHPLC柱，粒径有1.8μm和2.2μm两种规格，可耐受压力至10000psi，重现性好，柱校更高、分离效果更好、分离时间更短。色谱柱选择与使用注意事项试剂部分●Fax:[phone]●Tel:[phone]液相色谱柱使用注意事项1.色谱柱的平衡新的色谱柱在经过出厂测试后都会保存一定的溶剂中，然而，由于色谱柱在储存或运输过程中固定相可能会干掉，从而引起键合相的空间结构变化。因此，新的色谱柱在用来分析样品之前，需要充分平衡色谱柱。1.1反相色谱柱平衡方法：以纯乙腈或甲醇作流动相，用低流速，如0.2mL/min将色谱柱平衡过夜(注意：断开检测器)，然后，提高流速，如0.8mL/min冲洗30min以便将色谱柱填料充分平衡至最佳状态,平衡过程中，将流速缓慢地提高直至获得稳定的基线，这将有利于延长色谱柱的使用寿命，并在以后的使用中，获得分析结果的重现性。如果您所分析样品时使用的流动相中含有缓冲盐，应注意首先用20倍柱体积的不含缓冲盐的水相-有机相过渡，然后换成分析样品的流动相，直至得到稳定的基线。1.2正相色谱柱平衡方法：硅胶柱或极性色谱柱需要更长的时间来平衡。这些色谱柱在出厂测试后是保存在正庚烷(或正己烷)等非极性溶剂中，如果极性色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡。当使用乙醇、异丙醇、乙酸粘度大的流动相时，请使用低流速平衡，同时平衡时间要延长，甚至要加倍。如果使用了保护柱，请将保护柱和分析柱一起平衡。如果所用流动相中含有缓冲盐或离子对试剂，则需要较长的时间来平衡。每天用足够的时间来平衡色谱柱，就会在处理样品分离问题方面获得最大的“补偿”，而且您的色谱柱寿命也会变得更长。2.色谱柱的维护●为了延长色谱柱的使用寿命，应在分析柱前连接一个小体积的保护柱。保护柱内径一般为2-3mm，长不超过3cm，填充与分析柱相同的固定相。保护柱使用得当，对分离无明显影响。●在色谱柱使用过程中，应避免突然变化的高压冲击，这往往是由进样阀缓慢转动，泵突然起动引起，流速骤升骤降等原因引起。●对硅胶基体的键合固定相，流动相的pH一般保持在2.5～7.0。高pH的流动相会溶解硅胶，而低PH值的流动相会使固定的键合相脱落。●使用水溶性流动相时，为防止微生物繁殖引起柱阻塞，可加入0.01%的叠氮化钠，以抑制微生物的繁殖。●进样前，样品最好使用0.45um滤膜过滤或经固相萃取净化。3.色谱柱的清洗被分析样品包含许多化合物，如无机盐、类脂、脂肪、腐殖酸、疏水蛋白质以及其他生物化合物，有些物质会或多或少的取代被分析组分而被保留，但这种保留是较弱的，如无机盐通常易从柱中被水相洗脱出来。样品基体物质若被中等程度保留，可慢慢被洗脱，以宽峰、基线扰动或基线漂移表现出来。如果物质被强烈滞留，那么经过多次进样后这些被吸附的化合物会积聚在色谱柱柱头，这种情况在等度洗脱中会经常遇到。如果被吸附的物质含量高至足以覆盖部分键合固定相表面，成为一种“新”的固定相,那么会导致色谱峰的保留时间漂移并导致峰形拖尾。如果色谱柱被严重污染，其反压也会迅速增大，可能超过泵的最高压力限度，使分析无法进行。3.1反相硅胶键合相色谱柱的清洗反相硅胶键合相一般包括C18、C8、C4、苯基等，当用二元混合溶剂进行等强度洗脱时。为移去污染物，可用20个体积的强洗脱溶剂，如甲醇、乙腈或四氢呋喃来冲洗柱子。如果流动相中含缓冲盐溶液，为防止有机溶剂清晰造成的盐析出，阻塞管路，应首先用20个柱体积的不含缓冲盐的水-有机相溶剂冲洗色谱柱，然后再用强洗脱溶剂清洗柱子。如果用强洗脱溶剂仍不能驱除污染物，可以使用更强的溶剂或混合溶剂来洗脱。当需用一系列的有机溶剂清洗色谱柱时，应逐渐增加它们的洗脱强度，并确保溶剂之间的混溶性。对典型的反相硅胶柱，用于洗涤无缓冲盐的体系，推荐使用以下有机溶剂清洗系统：100％甲醇→100％乙腈→75％乙腈+25％异丙醇→100％异丙醇→100％四氢呋喃清洗后，按相反的顺序冲洗色谱柱，以返回到原始的流动相。如果使用者怀疑色谱柱被严重的污染或阻塞，可将二甲基亚砜与水或二甲基甲酰胺与水，以各自50％的比例混合，并以低于0.5mL/min的流速通过色谱柱。由于污染物聚集在色谱柱头，逆向冲洗会缩短污染物在柱中迁移的距离；又因为色谱柱皆在高于操作压力下填充的，通常逆向液流不会扰动色谱柱床。但如果色谱柱顶端过滤筛板的孔径大于柱底部过滤筛板的孔径，则固定相的微小粒子会在逆向冲洗过程通过筛板流出柱，从而会在柱中产生新的死空间引起柱床松动。因此在逆向冲洗前，应先确认柱管两端过滤筛板的孔径一致。除盐：对普通反相C18键合相柱，为除去柱中含有的缓冲盐类或水溶性物质时，不应使用纯水冲洗。因为C18键合相像一条长链将硅胶黏结，当有有机溶剂存在时，其表面被流动相润湿，C18长链完全展开，像海水中的海藻一样。当纯水或缓冲溶液通过时，C18键合相不能被浸润，键合相表面会塌陷，从而将溶剂、样品分子或无机盐分子包合。此时仅用纯水无法将包合物洗脱出，应使用含5％有机溶剂的水溶液冲洗，以清除无机盐或水溶性物质。蛋白污染：如果需从硅胶键合固定相清洗蛋白质残留物，必须使用和前述不同的程序。如果生物材料血浆或血清样品注入色谱柱，在大多数情况下，纯有机溶剂(如乙腈或甲醇)并不能溶解肽和蛋白质，用它们清洗色谱柱是无效的。然而，有时使用有机溶剂与缓冲物、酸或离子对试剂的混合物却是有效的。清洗反相柱中的蛋白质类物质，可使用表1溶剂系统。表1从HPLC反相柱中清洗蛋白质类物质使用的清洗溶剂系统溶剂组成乙酸1%水溶液三氟乙酸1%水溶液0.1%三氟乙酸-正丙醇40:60（较粘稠）三乙胺（TEA）-正丙醇40:60（混合前用磷酸调ph=2.5）尿素或胍的水溶液5-8mol/l(PH=6-8)NaCl、Na3PO4、Na2SO4水溶液0.5-1.0mol/l二甲基亚砜-水或二甲基甲酰胺-水50:50金属污染：有时清洗硅胶反相固定相需使用特殊的技术，如在早期硅胶键合相生产中，使用高金属氧化物含量的硅胶，金属离子会吸附在键合相表面，此时可使用0.05mol/EDTA冲洗，将金属离子螯合，再用纯水将可溶性螯合物洗掉。3.2正相硅胶键合相色谱柱的清洗正相柱一般包括硅胶柱、氰基柱、氨基柱和二醇基柱。如果该类色谱柱被污染，可通过如下方法清洗：1.每次清洗都用低流速起步，当检测到柱压稳定在一定水平后再增加流速。2.先用10柱体积不含其它添加剂的流动相中的弱溶剂，如正己烷、氯仿等反冲色谱柱色谱柱选择与使用注意事项试剂部分4液相3.再用20柱体积的诸如二氯甲烷或异丙醇等流动相中的强溶剂反冲色谱柱。4.100%异丙醇的极性和正相洗脱能力足够把正相柱上的所有残留物清洗掉。如果异丙醇的清洗还不足以恢复色谱性能，则说明色谱柱柱床有塌陷和空洞了，用清洗的方法无法解决这个问题。对于正相柱，出现保留时间漂移等选择性改变的一些色谱症状，填料可能还是完好的，主要原因可能是固定相的水分含量发生变化，大部分溶剂都含有小部分的溶解水分（正己烷20摄氏度下水分含量是0.0111%w/w),正相色谱柱中水分含量随时间的不同是导致选择性变化的最普通的一个因素。这就需要用含2.5%二甲氧基丙烷（dimethoxypropane）和2.5%冰醋酸的正己烷冲洗色谱柱30个柱体积，可以去除色谱柱中水分并恢复色谱柱原来或所需要的选择性。常用HPLC色谱柱的柱体积如表2所示表2常用色谱柱的体积柱尺寸（mm）4.6*2504.6*1503.0*1502.1*1504.6*50柱体积（mL）2.51.50.640.280.5常见故障排除故障现象可能的原因解决方法基线飘移正方向：污染物积聚／洗脱清洗色谱柱，净化样品，用纯溶剂负方向(梯度型)：流动相“A溶剂有吸收用不吸光或HPLC级溶剂正方向(梯度型)：流动相“B有吸收用不吸光或用更高的紫外波长正方向(梯度型)：流动相“B有吸收用不吸光或HPLC级溶剂随机性：温度变化将柱和管线使用恒温柱温箱波