4、相对定量：-ΔΔCT法和相对标准曲线法

相对定量：ΔΔCT法和相对标准曲线法2定量定量PCR:PCR:相对基因表达量相对基因表达量3目的基因:Plat1未处理样本处理后样本示例实验问题:样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化?4目的基因:Plat1示例实验未处理样本处理后样本问题:样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化?5实验流程t=0t=12t=24t=48对照样本timetotalRNAcDNAtotalRNAcDNAtotalRNAcDNAtotalRNAcDNA6ΔRnCyclesCt=23Ct=24ΔCt=24–23=1未处理组目的基因处理组目的基因目的基因与目的基因的比较2-∆Ct=1/27ΔRnCycles未处理组目的基因和内参基因处理组目的基因和内参基因如果加入内参基因会怎样呢?ΔCt=24–14=10Ct=24Ct=14Ct=13Ct=23ΔCt=23–13=102-∆∆Ct=18两种相对定量的方法比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法样本间的倍数关系样本间的倍数关系9两种方法的区别?•已知各个基因的扩增效率•不需要每次都做标准曲线•简单,经济,通量较高•每个基因都要做一条标准曲线•准确的扩增效率计算•工作量大,成本高,通量较低比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法10如何选择相对定量的方法？[Template]Ct目的基因内参基因ABCDEFGHIJ对应点相减A-F=ΔCt111对应点相减Ct目的基因内参基因ABCDHGEJIFA-F=ΔCt1B-G=ΔCt2C-H=ΔCt3D-I=ΔCt4E-J=ΔCt5[Template]如何选择相对定量的方法？12在Excel中制作图表ΔCt1ΔCt2ΔCt3ΔCt4ΔCt5A-F=ΔCt1B-G=ΔCt2C-H=ΔCt3D-I=ΔCt4E-J=ΔCt5ΔCt稀释点12345如何选择相对定量的方法？13根据斜率选择一种定量方法根据斜率选择一种定量方法比较Ct(ΔΔCt)法︱斜率︱≤0.1相对标准曲线法︱斜率︱≥0.1如何选择相对定量的方法？14相对标准曲线法相对标准曲线法15应该稀释什么样品来制作标准曲线?•任何数量充足，并表达目的基因和内参基因的浓度较高cDNA•只需知道稀释倍数,不需要知道浓度•养成好的制作标准曲线的习惯16每对引物做一条标准曲线18sInsulin10,00010001001016420.64171.410,0001000100101CtCtRelativeQuantityRelativeQuantityUntreatedCtTreatedCtUntreatedCt74.6TreatedCt202.317针对每对引物制作标准曲线[cDNA]Ct目的基因内参基因斜率=-3.38斜率=-3.3218计算举例UntreatedQavg.TreatedQavg.Insulin18s74.6202.36420.64171.4÷÷NormalizedQ0.01160.0484选择一个对照样本：例如,未处理样本Reference÷Reference:0.0116÷0.0116=1Treated÷Reference:0.0484÷0.0116=4.2表达倍数差异19软件计算为你计算好所有的倍数关系.20ΔΔCt法|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|9/28/201121ΔRnCyclesCt=22Ct=27t=12hΔRnCyclesCt=24Ct=26t=24hΔRnCyclesCt=23Ct=33t=48hΔRnCyclesCt=23Ct=30t=0内参基因目的基因ΔΔCt法22ΔΔCt法的必要条件两个基因(目的基因和内参基因)必须有相一致的扩增效率，并尽可能接近100%!23ΔΔCt法如何判断扩增效率一致同时扩增目的基因和内参基因，通过查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确定扩增效率是否相似。24检查指数增长期的曲线之间是否平行内参基因目的基因25|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|9/28/2011ΔΔCt法如何确认扩增效率接近100%K=-1/log(1+Ex)每对引物一条标准曲线26标准曲线可以帮助判断扩增效率•例如,斜率-3.3说明扩增效率接近100%.•更小的负值(例如-3.5)说明扩增效率小于100%.公式:E=10(-1/斜率)-127不想每次实验都做标准曲线？•另一个选择:预先确定每个基因的扩增效率…前提条件Vs.误差允许28•后续实验中采用ΔΔCt法.6不想每次实验都做标准曲线？29•分析时手动输入每个基因的扩增效率相对定量结果计算就会把每个基因的扩增效率计算进去不想每次实验都做标准曲线？30ΔΔCt反应板设置对未知样本的目的基因和内参基因进行定量(每个样本三个重复)无模板对照(NTCs)–污染监测31ΔΔCt法结果计算步骤2:其他和对照样本比较ΔCt处理样本–ΔCt对照样本=ΔΔCt步骤1:内参基因均一化样本差异Ct目的基因–Ct内参基因=ΔCt步骤3:使用公式计算22--ΔΔΔΔCtCt倍数变化=32公式含义?2CT2=循环间扩增产物量的倍数变化(i.e.PCR扩增产物量倍增)ΔΔCT=处理样本和对照样本之间校正过的循环数变化所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的基因的倍数变化33ΔΔCt计算示例UntreatedUntreatedTreated2Treated2Treated1Treated1CtCttargtarg..CtCtnormnorm..dCtdCtddCtddCt22((--ddCt)ddCt)26.116.79.40126.116.79.40123.816.07.823.816.07.8--1.631.6322.817.75.122.817.75.1--4.3204.320显示出两倍的表达差异.重复样本平均Ct值34UntreatedUntreatedTreated2Treated2Treated1Treated1CtCttargtarg..CtCtnormnorm..dCtdCtddCtddCt22((--ddCt)ddCt)26.116.79.40126.116.79.40123.816.07.823.816.07.8--1.631.6322.817.75.122.817.75.1--4.3204.320为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理ΔΔCt计算示例35UntreatedUntreatedTreated2Treated2Treated1Treated1CtCttargtarg..CtCtnormnorm..ΔΔCtCtddCtddCt22((--ddCt)ddCt)26.116.79.40126.116.79.40123.816.07.823.816.07.8--1.631.6322.817.75.122.817.75.1--4.3204.320ΔCt值=Ct目的基因–Ct内参基因.为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理ΔΔCt计算示例36为什么Ct值要相减而不是相除?•Ct值是指数值,而不是线性值.•因此,我们不能直接用Ct值相除.•用相减来比较Ct值.(例如:225÷220=25)37接下来,选择一个对照样本•所有其他样本都要和对照样本进行比较没有对照样本...Untreated:.074Treated1:.148Treated2:.222/.074/.074/.074有对照样本...Untreated:1Treated1:2-倍增长Treated2:3-倍增长38选择一个对照样本UntreatedUntreatedTreated2Treated2Treated1Treated1CtCttargtarg..CtCtnormnorm..ΔΔCtCtΔΔΔΔCtCt22((--ddCt)ddCt)26.116.79.40126.116.79.40123.816.07.823.816.07.8--1.631.6322.817.75.122.817.75.1--4.3204.320首先,均一化所有样本(如：对照样本–对照样本).接着,所有样本和对照样本进行比较(未知样本–对照样本).39ΔΔCt倍数计算UntreatedUntreatedTreated2Treated2Treated1Treated1CtCttargtarg..CtCtnormnorm..ΔΔCtCtΔΔΔΔCtCt22((--ΔΔΔΔCt)Ct)26.116.79.40126.116.79.40123.816.07.823.816.07.8--1.631.6322.817.75.122.817.75.1--4.3204.320最后计算出倍数关系:2-ΔΔCt相对定量(RQ)值40•还记得开始时的相对定量实验吗?•我们来算一下基因表达变化41Samplec-mycAverageCtGAPDHAverageCtΔCtc-myc-GAPDHΔΔCtΔCttreated-ΔCtuntreatedFolddifferenceinc-mycrelativetountreatedTime030.4923.636.860.001.0Time=12hr27.0322.664.37-2.505.6Time=24hr27.0623.20Time=48hr32.8323.013.869.82-3.002.968.00.13相对定量结果计算42123455.68.01t=0t=12ht=24ht=48h0.13Calibratort=0相对定量结果678GeneExpression43软件计算为你完成所有的计算!44Question?