定量蛋白质组学研究技术.

细胞工程教研室第九章定量蛋白质组学研究技术石晓卫E-mail：[e-mail]细胞工程教研室定量蛋白质组学•定量蛋白质组学是指把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中的目标蛋白质进行精确定量和鉴定。•这一概念的提出标志着蛋白质组技术的不断改进和完善。蛋白质组学研究已从对蛋白质简单的定性向精确的定量方向发展。细胞工程教研室细胞工程教研室主要内容※定量技术体系与分类※荧光染料分析法※同位素标记技术※针对性亲和标签技术※同位素标记技术的应用细胞工程教研室一定量技术体系和分类☻技术体系双向电泳-质谱技术体系蛋白质芯片分析体系基于同位素标记的质谱分析技术体系细胞工程教研室2-DE-MS技术体系•无标记的蛋白质双向电泳•荧光差异凝胶电泳•基于同位素标签和自动化的串联质谱细胞工程教研室☻定量分析方法定性差异分析和定量差异分析绝对定量和相对定量凝胶差异分析和非凝胶差异分析标记定量法和无标记定量法细胞工程教研室二荧光染料分析法♣双向电泳（2-DE）凝胶染料显示考马斯亮蓝银染荧光染色荧光标记细胞工程教研室♣荧光双向差异凝胶电泳（2D-DIGE）目前，在传统2-DE技术的基础上发展出的2D-DIGE，采用专有的荧光染料（Cy2、Cy3、Cy5）与多重样本和图象分析的方法，在同一块胶上可同时分离多个由不同荧光标记的样品，并以荧光标记的样品混合物为内标，对每个蛋白质点和每个差异都可以进行统计学可信度分析，从而具有良好的重复性和较高的准确率。另外，由于荧光染料的使用，使得2D-DIGE具有高灵敏度的特性，能够满足高通量定量蛋白质组学研究分析的要求。细胞工程教研室细胞工程教研室荧光扫描仪细胞工程教研室细胞工程教研室三同位素标记技术♫原理多肽和蛋白质的质谱响应值受许多难以控制的因素的影响，特别是其离子化效率受其他物质和条件的影响很大，具有很强的体系依赖性，因而不能对来自相同肽段两次质谱检测得到的信号强度像色谱定量中那样进行比较定量。细胞工程教研室一个肽的惟一适合的内标准是标记有稳定同位素的同一个肽。所以，在完整蛋白或消化后的多肽中引进稳定同位素（如2H、13C、15N、18O）标记的小分子，用来识别不同样品来源的肽段，经“轻”质和“重”质同位素标记的不同多肽互相作为内标，化学性质基本上是一样的，这样就可以确保同一次质谱扫描中两者的离子化效果是相同的，此时肽质谱峰信号成对出现，质谱峰的信号强度就可以作为定量的依据。它们的相对强度就精确地反映了原样品中多肽的比例（也就是蛋白的比例）。细胞工程教研室♫分类同位素标签引入方法•生物代谢方式•化学方式•酶解过程引入同位素标记引入法•体内标记【代谢标记法（SILAC）】•体外标记【化学标记法（ICAT）】细胞工程教研室۩生物代谢方式引入标记原理将一定量的相同种类但表达水平不同的两个（细胞）样品分别置于正常培养介质和富含某重质同位素（如：15N）的相同介质中培养，一定时间后将两者混合酶解，然后选择性亲和分离、色谱分离，并进行质谱分析。细胞工程教研室方法15N/14N蛋白质标记技术分别用富含15N/14N的细胞培养基培养要比较的细胞或者简单生物体，通过生物代谢的方式以15N替代氨基酸组成中的14N，进而把15N标记引入蛋白质组成中。由于氨基酸组成的不固定（从甘氨酸的1个到精氨酸的4个），因此还没有把此标记用在细胞培养上的报道。细胞工程教研室细胞培养条件下稳定同位素标签技术（SILAC）通过细胞的正常代谢，把稳定同位素标记的氨基酸引入到蛋白质组成中，大大简化质谱定量分析前人工处理的复杂度。可用在细胞培养条件下的稳定同位素有：2H、13C和15N等。细胞工程教研室细胞工程教研室۩酶解过程引入标记18O/16O水在两个要比较的蛋白质样品的酶解过程中分别加入18O和16O水，这样可特异性地对酶解肽段的C末端进行标记，等量混合后进行质谱分析样品间蛋白质组的差异。混合样品须快速鉴定。酶解标记H218O在H218O的溶液中进行蛋白质酶解，可在其C端稳定结合1或2个18O原子。细胞工程教研室整体内标技术（GIST）通过用N-acetoxy-[2H3]-succinimide/N-acetoxy-succinimide(NAS)乙酰化处理酶解肽段，把同位素标签引入样本分析体系中。NAS可标记必需氨基酸亲和肽段的N末端。由于肽段的乙酰化位点不一，被标记的重链和轻链质量差也不固定，给自动化分析带来了一定困难。细胞工程教研室۩亲和标签法引入标记原理同位素标记亲和标签技术（ICAT）由Gygi等于1999年发明。此技术是利用同位素亲和标签试剂，预先选择性地标记某一类蛋白质，分离纯化之后进行MS鉴定。根据MS图上不同同位素标记亲和标签试剂标记的一对肽段离子的强度比值定量分析样品的相对丰度。细胞工程教研室ICAT试剂组成：反应基团（特异性结合肽链中半胱氨酸残基的巯基）连接子（结合稳定同位素）亲和标签—生物素（可与卵白素结合，选择性分离标记的多肽）细胞工程教研室操作流程同位素标记亲和标签轻试剂标记的细胞蛋白质1同位素标记亲和标签重试剂标记的细胞蛋白质2混合，胰酶水解阳离子交换卵白素亲和层析LC分离，MS分析，数据库检索细胞工程教研室优点兼容任何生长条件下的组织中的蛋白质样品；烷基化反应高度特异；只分离含有半胱氨酸残基的肽段，降低了体系的复杂性；可对膜蛋白进行鉴定和定量；建立在色谱技术的基础上，任何促进蛋白质溶解的试剂都可使用；能直接鉴定和测量低丰度的蛋白质。细胞工程教研室缺点无法分析不含半胱氨酸的蛋白质；同位素标签的存在影响肽段检测和增加数据库搜索的复杂性；被标记的含有两个半胱氨酸的多肽质量相差16u时与氧化作用很难区分；样品成分复杂时，定量误差会增大标记效率具有时间依赖性，很难达到80%。细胞工程教研室应用测定和定量膜蛋白鉴定和定量低丰度蛋白质细胞工程教研室۩ICAT技术改进☻用13C/12C代替2H/1H，消除LC的同位素效应☻固相同位素标记亲和标签☻可剪切同位素标记亲和标签（酸切割或光切割）可裂解同位素标记亲和标签（cICAT）可视同位素标记亲和标签（VICAT）细胞工程教研室♣固相同位素标记亲和标签其是将ICAT试剂与玻璃珠结合，使之固相化，通过固相捕捉和释放等化学反应过程，LC／MS-MS分析蛋白质的肽段。该方法与传统的ICAT方法相比，更简单，更灵敏，更有效。而最大不同是固相ICAT试剂标记蛋白质是在酶解后进行，而ICAT试剂标记蛋白质要求在酶解前。固相同位素标签试剂由4部分组成，氨丙基包被的玻璃珠、含有O-硝基苯的光裂解连接子、连接7个氢或7个氘的亮氨酸同位素标签和巯基特异反应的碘乙酰胺基团。细胞工程教研室♣可裂解同位素标记亲和标签用13C/12C代替了2H/1H使用了酸裂解连接子不同肽段质量相差9u或9u的倍数亲和标签试剂由3部分组成•半胱氨酸特异性反应基团•含9个同位素13C或12C标签的可裂解连接子•亲和纯化生物素细胞工程教研室♣可视同位素标记亲和标签是在cICAT技术的基础上实现绝对定量的改进方法。亲和标签试剂由3种不同的同位素标签组成。•用来标记样品的巯基标记标签（VICAT）•标记内标多肽标签（14C-VICAT+6）•等电聚焦标记标签（14C-VICAT-28）细胞工程教研室细胞工程教研室♣同位素标记相对定量和绝对定量ICAT技术每次实验只能对两个样品进行相对定量。新近出现的多重元素标记的同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）在一定程度上解决了这一问题。它是2004年由ABI公司推出的一种可以同时对四组样品进行定量分析的方法，对于实验设计比较多组样品给予了有力的支持。细胞工程教研室iTRAQ试剂是非多聚体的等质量标记试剂，是由四种试剂组成的一组试剂，这四种试剂的分子量相同。每一种试剂都包括三部分：一个报告基团（分子量分别为114u、115u、116u和117u）、一个平衡基团（分子量分别为31u、30u、29u和28u）和一个与肽段反应的基团。当我们需要同时比较四组不同样品时，样品分别跟四种iTRAQ试剂结合，然后混合在一起做质谱鉴定。细胞工程教研室细胞工程教研室与ICAT试剂相比优点是通量大。iTRAQ试剂对氨基的标记是一种普遍标记的模式，它的几乎所有的肽段都能被标记。但是，如果用这种普遍标记的方法来大规模的鉴定和定量蛋白质(理论上说，每个蛋白质只要有一条肽段就可以对其进行鉴定和定量)，则是一件费时费力的事情。另外，在iTRAQ试剂标记需要反应体系的有机相体积高达60％以上，蛋白质样品很容易发生沉淀而损失，这也是该试剂的一个弱点。细胞工程教研室四针对性亲和标签技术磷酸化蛋白质同位素标记亲和标签PHIAT技术是建立在ICAT技术基础上的研究和鉴定磷酸化蛋白质磷酸化位点的新方法，且对低丰度蛋白质的鉴定有效。PHIAT试剂含有亲核的巯基和同位素标签及其共价结合的生物素基团。利用此方法已成功鉴定了酪蛋白和酵母提取物的磷酸化位点。细胞工程教研室选择性标记特异性氨基酸同位素的化学探针标记半胱氨酸标记色氨酸标记氨基酸N末端标记羧基标记细胞工程教研室非同位素的化学探针标记（Label-freeLCMS/MS）赖氨酸标记质量丰度编码标签（MCAT）是一种色谱标记定量法。组氨酸标记利用了固相金属亲和色谱可富集含有组氨酸的肽段的特性。甲硫氨酸标记细胞工程教研室五同位素标记技术应用•补充双向电泳的不足•解决大分子复合物及相互作用问题•诱导发现细胞新通路机制•翻译后修饰•信号分子分析•疾病分析与药物筛选细胞工程教研室思考题•定量蛋白质组学的含义。•简述同位素标记技术的原理和方法。•简述同位素标记亲和标签技术的原理。•同位素标记亲和标签技术有哪些改进。•为什么同位素标记技术能够得到应用和不断发展？细胞工程教研室