第十章-植物种质的超低温保存分析

第十章植物种质的超低温保存种质保存的概念•种质保存：利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源，使个体中所含有的遗传物质保持其完整性，有高的活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。种质保存的途径•种子保存：种子生活力逐渐下降；易受病虫鼠害侵扰。•种植保存：占地多，管理费用高。•离体（组织培养）保存：不断继代培养可能导致培养物的染色体和基因型的变异；费用较高•超低温冷冻保存：在液氮超低温下保存种质的技术。应用前景广阔。一、离体保存方法•使保存种质处于缓慢生长或无生长状态，需要时可迅速恢复生长。•抑制生长的方式：–降低温度–降低环境中的氧含量–使用生长延缓剂–其它方法离体种质保存的优点•占用空间少，节省人力、物力和土地；•便于种质资源的交流利用；•需要时，可以利用离体培养方法很快大量繁殖；•避免自然灾害引起的种质丢失。二、超低温冰冻保存技术（一）原理•原理：液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长都停止了，因而排除了遗传性状变异的可能性，达到长期保存植物种质的目的。•在超低温储藏中，植物材料不仅能长期保持形态发育的潜能，还能保持遗传性状的稳定，是迄今唯一不需要继代的、可靠的长期保存方法。（二）关键问题及解决措施•关键问题：在超低温条件下，冰冻过程中避免细胞内水分结冰，解冻过程中防止细胞内水分次生结冰。•解决措施：–选取细胞内自由水少、抗冻力强的植物材料；–采取预处理措施，提高植物的抗冻力；–在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成；（三）基本程序•1、材料的选择：–组织、细胞特征：细胞分裂旺盛、体积小、原生质浓厚的分生细胞或组织；–培养时期：旺盛的对数生长期（抗冻力和存活率高）–大小：适宜（三）基本程序•2、材料的预处理–处理目的：减少细胞内自由水的含量，使细胞经受低温锻炼，以提高组织或细胞的抗冻能力。–处理方法：•低温锻炼•预培养，加入提高材料抗冻能力的物质（如DMSO、蔗糖）（三）基本程序•冰冻保护剂0℃预处理•如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓度下对细胞无毒害；化冻后容易从组织细胞中清除。•常用的冰冻保护剂：DMSO、甘油、糖、PEG等。（三）基本程序•3、降温冰冻操作–1）直接快速冷冻–2）分级冰冻法–3）玻璃化法–4）干燥冷冻法–5）包埋冻存法快冻法•0℃（或其它预处理温度）直接进入液氮。•降温速度：每分钟1000℃以上。•适用对象：–高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎、块根等。–抗寒性较强或经过低温锻炼的植物，如某些木本植物的枝条或芽。分级冷冻法•适用对象：不抗寒的植物或含大液泡和大量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞等）•程序降温仪起始温度0.1-10℃的降温速度-70℃~-40℃液氮两步冷冻法转移温度分级冰冻法•逐级冰冻法：将经保护剂处理的材料在0℃预处理后，依次通过不同温度的冰冻，如-10℃、-15℃、-23℃、-40℃等，一般每级约停留5min，然后学好入液氮。玻璃化法•玻璃化：液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。•原理：将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固，形成无规则的玻璃化液，将玻璃化液和材料一起处理一段时间后投入液氮中，此时冰冻保护液和材料一起进入玻璃化状态（冰冻过程中水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生结构和体积的改变。玻璃化法•优势：设备简单、操作方便、冻存效果好。•影响因素：玻璃化冰冻保护液的组成及浓度；植物材料的脱水温度和脱水时间。•4、化冻操作•快速化冻：适用于大多数材料•慢速化冻法：适用于含水量较低的材料•（5、去除冰冻保护剂）•6、化冻材料的活力检测：•根本方法：再培养（三）基本程序THEEND