双水相萃取

利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。双水相萃取？双水相的形成将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系。这种含有不同聚合物分子的溶液发生分相的现象叫聚合物的不相容性。形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。常用的双水相体系高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG)/葡聚糖(简称Dextran)高聚物/无机盐体系：硫酸盐体系。常见的高聚物/无机盐体系为:PEG/硫酸盐或磷酸盐体系。双水相系统(aqueoustwo-phasesystem,ATPS)PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸钾DX=葡聚糖(dextran)•双水相萃取的原理•是生物物质在双水相体系中的选择性分配，当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种作用力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同，即分配系数不同。第一节双水相分离理论双节线：把均相区和两相区域分隔开。系线：连接双节线上两点的直线。均相区两相区在同一条系线上的各点分成的两相具有相同的组成，但体积比不同临界点：当系线长度趋向于零时，即在图中的C点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，成为单相体系。ATPS相图双节线(bi-nodal)：图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区，即ATPS。系线(tieline)：双节线上两点的直线。系线反映的信息A杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则B性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小.C临界点(criticalpoint)：当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如K点。对于PEG/Dextran所形成的双水相体系中，若降低PEG相对分子质量，则生物分子分配于富含PEG的上相中，使分配系数增大；而降低Dextran相对分子质量，则分配系数减小。若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于PEG聚合物，应降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率，则平均分子量应增加。(1)成相聚合物的影响A、成相聚合物分子量B、成相聚合物的浓度•聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的长度为零，此时分配系数为1，即组分均匀的分配于上下相.•随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓度增大，系统远离临界点，系线长度增加，两相性质的差别(疏水性等)增大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=1)，即大于1或小于1。因此,成相物质的总浓度越高，系线越长，蛋白质越容易分配于其中的某一相。(2)盐的种类和浓度盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反映在对相间电位和蛋白质疏水性的影响。①盐的种类•在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数，不同电解质的正负离子的分配系数不同，从而产生不同的相间电位。由于各相要保持电中性，使得带电生物大分子，如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。②盐的浓度•盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。例如，PEG/磷酸盐体系中上下相的PEG和磷酸盐浓度及Cl-在上下相中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变，这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质的分配系数，如图。离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这一特点，通过调节双水相系统的盐浓度，可有效地萃取分离不同的蛋白质。（4）温度的影响分配系数对温度的变化不敏感成相聚合物对蛋白质有稳定化作用,所以室温操作活性收率依然很高,而且室温时粘度较冷却时(4℃)低,有助于相的分离并节省了能源开支。（一）目的物的萃取1、如果目标产物在上相中的分配系数足够大，则细胞匀浆液中的目标产物可采用一步或两步双水相萃取工艺获得较高的纯化倍数。一步双水相萃取：是把生物材料悬浮液和双水相系统混合后，其中下相含有大多数杂质，而上相含目标产物。两步双水相萃取：把一步萃取体系中的上相分离出来后，再加入盐使其形成新的双水相体系，则富含PEG的上相得到回收，同时，含有目标产物的盐相通过超滤等操作得到分离目标。三步双水相萃取酶的流程示意图2、如果细胞匀浆液中的目标产物的分配系数较小，则可采用多步双水相萃取工艺以获得较高的纯化倍数。（二）PEG循环•在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。•PEG的回收有三种方法：•①加入盐使目标产物转入富盐相来回收PEG；•②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去PEG，再洗出蛋白质。•③超滤（三）无机盐的循环•一种方法使将含磷酸钠的盐相冷却到6℃，使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；•另一种方法是用电渗析法、膜分离法回收盐类。二、大规模双水相萃取及其简单设备两步萃取法连续分离胞内酶的流程示意图第三节双水相萃取技术在生物、食品工业中的应用•（1）提取酶和蛋白质。•（2）进行萃取性生物转化•（3）酸水解产物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等风味物质•（4）萃取细胞、细胞器、膜等粒子•（5）应用于液－液分配层析•双水相的应用举例•分离和提纯各种蛋白质(酶）•用PEG/-(NH4)2SO4双水相体系,经一次萃取从α-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶,萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%),pH=8,α-淀粉酶收率为90%,分配系数为19.6,蛋白酶的分离系数高达15.1。比活率为原发酵液的1.5倍,蛋白酶在水相中的收率高于60%。•提取抗生素和分离生物粒子•采用PEG/Na2HPO4体系提取丙酰螺旋霉素，最佳萃取条件是pH=8.0～8.5，PEG2000(14%)/Na2HPO4(18%),小试收率达69.2%,对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53.4%第四节双水相萃取分离技术的发展方向一、开发廉价的新型双水相体系例如：用粗dextran、变性淀粉、糊精、乙基羟乙基纤维素等取代葡聚糖（dextran）二、双水相分配与相关技术的集成化集成化：不同分离技术上的相互渗透、实现优势互补，而达到整体优化的目的。具体表现3个方面：①与常规技术结合解决双水相萃取本身的难点问题②引进其他分离技术进行融合以提高分离效率，简化分离过程③为已有的技术提供新的思路实验（设计型）•设计一个PEG/磷酸盐的双水相体系，并从番木瓜中初步萃取木瓜蛋白酶。思考题•名词解释：聚合物的不相容性；相图。•双水相体系的是怎样形成的？其组成是什么？•影响双水相萃取的因素有哪些？•双水相萃取技术有什么优越性？