荧光定量PCR技术和原理详细讲解

7500Real-TimePCR安装培训ChinaServiceDepartment内容简介内容简介●一、基本原理●二、化学原理●三、技术应用●四、实时定量PCR概述●五、仪器软件（现场演示）一、基本原理一、基本原理什么是什么是RealReal--timePCR?timePCR?实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术Technologytomonitor,inreal-time,thePCRamplificationofspecificnucleicacidtargetsRealReal--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●和传统PCR一样具有以下基本要素dsDNADNA模版,primers引物,dNTPs核苷酸,PCRbuffer缓冲液,TaqpolymeraseDNA聚合酶等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+TACGGAGCTGARealReal--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●在控温模块（TemperatureBlock）上实现循环反应»Denaturatingoftemplate（模板变性）»Annealingofoligos（引物退火）»Extensionofprimerstomakenewproducts（序列扩增）N个cyclesRealReal--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●在PCR混合液中含有荧光物质（荧光物质（fluorescencefluorescence））RealReal--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●Real-TimePCR仪包括thermalblock控制温度,halogenlamp激发荧光,filters,和CCDcamera检测信号ThermalcyclingblockCCDcameraHalogenlampExcitation/emissionfiltersPCRPCRLotsofPCRPCRproductRealReal--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●随着扩增的进行,荧光信号会随着PCR产物的增加而增加RealReal--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●Real-timePCR仪会纪录每个循环经过每个滤光片的荧光信号变化Cycle1FilterASample1Level:RealReal--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●最后,real-time软件会对采集到的数据进行分析二、化学原理二、化学原理支持的化学试剂支持的化学试剂SYBRSYBR®®GreenIGreenITaqManTaqMan®®TaqManTaqMan®®化学原理化学原理((又称又称55’’--Nuclease)Nuclease)TaqManTaqMan®®中会使用到两段短片段序列中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物，称为双向特异引物第三段短片段序列，又称为探针第三段短片段序列，又称为探针,,位于位于序列中间序列中间报告染料Reporterdye淬灭染料Quencherdye探针标记两种探针标记两种染料分子染料分子Reporter没有荧光信号（发射）能量光(激发)完整的探针完整的探针光能然而，如果探针断裂了然而，如果探针断裂了…………TaqManTaqMan®®进行中进行中…………DenaturationDenaturation变性变性(95(95ººC)C)AnnealingAnnealing退火退火(60(60ººC)C)TaqTaq酶登场酶登场…………找到引物序列找到引物序列…………开始延伸开始延伸(60(60ººC)C)ExtensionExtension延伸延伸(60(60ººC)C)ExtensionExtension延伸延伸(60(60ººC)C)?ExtensionExtension延伸延伸(60(60ººC)C)Taq酶很特别……●具有核酸外切酶活性，可以‘吃掉’结合到模板上的DNA片段TaqTaq酶降解探针酶降解探针TaqTaq酶降解探针酶降解探针TaqTaq酶降解探针酶降解探针嗝!每个循环之后每个循环之后●理论上，反应管里的目标片断数会加倍。●报告荧光信号相应成比例增长。RealReal--TimeTime扩增检测扩增检测Fluorescence荧光信号循环数ABI7500TaqManABI7500TaqMan®®荧光染料选择荧光染料选择报告荧光分子:FAM™,VIC®,JOE™,NED™,CY3™,CY5™,TexasRed®淬灭荧光分子:TAMRA™,MGB(non-fluorescent)SYBRSYBR®®GreenIGreenI化学原理化学原理SYBRSYBR®®GreenIGreenI染料染料SYBRSYBR®®GreenIGreenI染料染料SYBRSYBR®®GreenIGreenI染料染料SYBRSYBR®®GreenIGreenI染料的缺点染料的缺点非特异结合任意双链DNA定量结果不准确非特异性PCR产物信号使用使用MeltcurveMeltcurve检查反应特异性检查反应特异性TemperatureÆFluorescenceMeltcurve:Meltcurve:导数图谱导数图谱一个干净的峰=没有无关的产物TemperatureÆFluorescenceMeltcurveMeltcurve的杂峰的杂峰可能是引物二聚体到底用哪一种化学方法呢？到底用哪一种化学方法呢？TaqMan®,还是SYBR®Green?...TaqManTaqMan®®,,还是还是......SYBRSYBR®®GreenI?GreenI?●优点–更高的特异性–不会有引物二聚体干扰–支持多重荧光实验设计–实验方法易于优化●缺点–价格稍贵●优点–价格便宜–大部分基因以及少量样品均适用●缺点–特异性稍差–必须要做Meltcurves–不支持多重荧光设计–实验方法通常需要优化三、技术应用三、技术应用ABAB支持支持33种技术应用种技术应用Presence/Absence++++--++AllelicDiscriminationEnd-point终点检测QuantitativePCRReal-time实时检测终点检测终点检测vs.vs.实时检测实时检测●End-point方法–不需要实时数据收集–只需要2分钟样品扫描。–不是定量实验，是定性实验。–可以在普通PCR仪上完成扩增。终点检测终点检测vs.vs.实时检测实时检测●Real-time方法–使用实时定量PCR仪，在每个循环后采集数据。–任何定量实验所必须的。四、实时定量四、实时定量PCRPCR概述概述PCRPCR有三个显著阶段有三个显著阶段●几何级数扩增期(常称对数对数或或指数指数扩增期扩增期)●线形扩增期●平台期PCRPCR产物产物(log(log图谱图谱))PCRPCR循环数循环数指数指数//对数扩增对数扩增PCRPCR的三个阶段的三个阶段指数指数//对数扩增对数扩增线性扩增线性扩增PCRPCR产物产物(log(log图谱图谱))PCRPCR循环数循环数PCRPCR的三个阶段的三个阶段指数指数//对数扩增对数扩增线性扩增线性扩增PCRPCR产物产物(log(log图谱图谱))PCRPCR循环数循环数平台期平台期停!PCRPCR的三个阶段的三个阶段定量实验定量实验●只有一个扩增期提供高质量，可重复性数据...指数指数//对数扩增期对数扩增期1:1:重复性重复性实验结果可重复实验结果可重复((相同样品的扩增曲线集中相同样品的扩增曲线集中))40identicalreplicates2:2:准确性准确性接近真实值接近真实值((最好完全射中靶心最好完全射中靶心))3:3:动态范围动态范围兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围((越大越好越大越好))指数指数//对数扩增期对数扩增期重复性重复性准确性准确性动态范围动态范围3个阶段中最佳时期指数指数//对数扩增期对数扩增期ÆÆ好！好！10-folddilutionsofasinglesample(Logfluorescentscale)指数/对数线形扩增期线形扩增期ÆÆ不太好！不太好！10-folddilutionsofasinglesample(Logfluorescentscale)指数对数线性平台期平台期ÆÆ差！差！10-folddilutionsofasinglesample(Logfluorescentscale)指数/对数平台线性RealReal--TimePCRTimePCR专用术语专用术语BaselineBaseline基线基线定义背景区域:cycle-to-cycle范围在哪里设置在哪里设置baselines?baselines?通常起点为cycle3...在哪里设置在哪里设置baselines?baselines?终点设置在实验信号脱离噪音信号上升前可以使用可以使用AutoBaselineAutoBaseline设置设置软件自动为您选定基线区域AutobaselineAutobaseline●每个样品单独设置基线。●可以使每个样品拥有“完美”基线。●可以照顾到既有高浓度样品也有低浓度样品的实验。AutoBaselineAutoBaseline会失败吗会失败吗??●会...–某些样品的Baseline会很短，出现S型弯曲。解决办法:使用ManualBaseline设置基线ThresholdThreshold阈值阈值在扩增曲线上，可以调节的一条水平线告诉软件到哪里获得分析数据ThresholdThreshold在哪里设置阈值在哪里设置阈值??最佳位置:重复性最高的地方软件默认软件默认AutoThresholdAutoThreshold软件自动设置阈值AutoThresholdAutoThreshold自动阈值自动阈值●对于不同的批次的实验，软件单独设置阈值●因为不同批次的实验，会有不同的指数/对数扩增期Cyclethreshold(Cyclethreshold(又称又称Ct)Ct)扩增曲线与阈值的焦点，对应的带小数点的循环数Thiscurvecrossesthethresholdatcycle23.1Question:就定量而言，Ct有什么意义?Answer...没有意义。需要把Ct转化为有意义的数值可以使用标准曲线可以使用标准曲线//稀释曲线稀释曲线107106105104103倍比稀释实验结束后，根据未知样品的实验结束后，根据未知样品的CtCt读取未读取未知样品浓度知样品浓度Standard/dilutionamt.Cycle(Ct)Qty=2,50010100,00010,0001000100UnknownCt如果你不喜欢标准曲线如果你不喜欢标准曲线//稀释曲线稀释曲线??三组不同起始浓度的未知样品三组不同起始浓度的未知样品28Sample1Sample1CyclenumberCyclenumber2930Sample2Sample2Sample3Sample3Q:Q:为什么要用不同的起始浓度？为什么要用不同的起始浓度？28Sample1Sample1CyclenumberCyclenumber2930Sample2Sample2Sample3Sample3相对比较相对比较......？？Yes!Yes!因为因为PCRPCR每个循环之后产物加倍每个循环之后产物加倍......28Sample1Sample1CyclenumberCyclenumber2930Sample2Sample2Sample3Sample3ΔΔCt=1Ct=1TwoTwo--folddifferencefolddifference现在可以看出隐藏的数学关系了