考马斯亮蓝测蛋白实验报告

实验二：分光光度计的学习之考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）测定蛋白质含量定一实验目的学习分光光度计的基本原理和使用方法，并使用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。二实验原理考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。三实验材料1.实验材料：未知浓度的牛血清样品2.主要仪器：试管、移液枪、分光光度计等。3.试剂：蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。四实验步骤标准曲线制作：取6支10mL干净的试管，按表1取样。摇匀后放置2min，用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。表1低浓度标准曲线制作管号0123451mg/ml标准蛋白(ml)00.020.040.060.080.10蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250（ml）555555蛋白浓度（mg/ml）00.020.040.060.080.10OD595nm00.3390.4910.6010.7750.799上图数据标准曲线如下：拟合标准方程：y=7.7329x+0.11422．未知蛋白质浓度的测定另取2支10mL试管，按下表取样。吸取测定液0.1mL，蒸馏水0.9mL放入试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线0号试管做空白。五实验结果待测样品的吸光度1为0.240，待测样品的吸光度2为0.266，平均值为0.253。代入标准曲线得知x为0.0018，所以浓度为0.018mg/ml。六、实验分析（一）经测量得每毫升测定液中蛋白质的含量很低，是样品本身蛋白含量少还是实验操作造成，还需进一步分析。（二）考马斯亮蓝法测定未知蛋白浓度：优点：1、灵敏度高；2、测定快速、简便，只需要加入一种试剂；3、干扰物质少。缺点：一般分光光度法都有较大的机器误差（重复性较差），为了数据准确，需要每次进行标准曲线的测定。七、注意事项1.在测量前应把分光光度计预热半小时，打开开关时，先确定开关按钮的置，切不可凭直觉乱摸。2.称量样品前，电子天平要归零，称量时要精准。3.溶液一定要配制准确,以防影响实验效果,保证点在一条直线上。4.在作标准曲线进行定量前一定要选择最大的吸收波长,确保灵敏度高。5.在实际操作中，比色皿在使用中应注意保持干净，更不能触摸比色皿的光面，以防摩擦影响通光。