3-基因工程在环境污染治理中的应用

Foundedin1895第3讲基因工程在环境污染治理中的应用Foundedin18951基因工程•基因工程是在分子水平上对生物遗传特性进行人为干预，对生物基因进行改造，利用生物生产人们需要的特殊产品•理论上的三大发现–上世纪40年代，发现生物的遗传物质是DNA：Avery肺炎双球菌转化实验–50年代，发现DNA的双螺旋结构–60年代，确立遗传信息的传递方式：操作子学说，密码子破译•技术上的三大发明–工具酶：核酸内切酶，连接酶–载体：质粒–逆转录酶：打破中心法则•1973年，完成了DNA的体外重组并成功转化Foundedin1895分子生物学基础•DNA即脱氧核糖核酸，携带决定生物遗传，细胞分裂、分化、生长以及蛋白质生物合成等生命信息•DNA分子的基本单位是脱氧核糖核苷酸，由碱基、脱氧核糖和磷酸基三部分组成•碱基有四种：A、G、C、TFoundedin1895•碱基携带遗传信息，糖和磷酸基起结构作用•DNA分子的骨架由磷酸二酯键连接的多个脱氧核糖组成•一个脱氧核糖核苷酸中五碳糖的3’羟基，通过一个磷酸二酯键与邻近五碳糖的5’磷酸基相连Foundedin1895DNA的结构•双螺旋结构的要点–两链平行反向且右旋–碱基以氢键互补配对，A=T，G≡C–螺旋每周含10个碱基对，每周垂直升高340nm，螺旋直径200nm–核主链在螺旋外侧，碱基对平面在内侧且与主链垂直Foundedin1895•双螺旋模型可以解释–细胞减数分裂与有性生殖：配子与受精卵的形成–个体发育：受精卵的发育–遗传与变异：碱基序列的保守性、可变性–性状控制：蛋白质的生物合成•双螺旋模型的补充–DNA分子双链可以左旋：Z-DNA–DNA分子每圈碱基数具可变性：A-DNA–发现三股DNA–超螺旋结构普遍存在Foundedin1895碱基配对•一条链中的A与另一条链中的T配对，G与C配对，两条链中的碱基序列总是互补的Foundedin1895DNA的复制•从复制起始点开始•半保留复制：两条链均可作为新链合成的模板•半不连续复制：DNA序列的方向性•高度的忠实性：自我校正•多种酶和蛋白因子协同有序作用Foundedin1895DNA的变性、复性与杂交•加热或某些试剂可使DNA碱基间的氢键破坏，双链发生分离，此过程称为变性•变性DNA在一定条件下能恢复双螺旋结构，此过程成为复性Foundedin1895•G+C含量高的DNA比较稳定，环状DNA比线状稳定•Tm值：熔点，DNA发生半数变性时的温度•通过测定DNA的Tm值，可以计算其G+C含量•DNA的复性速度跟其分子大小、复杂程度、浓度、离子强度、温度等因素有关Foundedin1895DNA的杂交•复性的DNA分子由不同来源的两个单链DNA分子形成，称为杂交•互补的碱基序列即可发生杂交，一定条件下也可发生少量的偏差（错配、缺失）•利用分子杂交可以求出特定基因的频率、异源DNA的相似程度，研究基因组织、基因定位•分子杂交广泛应用于生物工程、核酸结构分析及功能探讨中，也是研究分子遗传学的重要手段Foundedin1895中心法则•除某些病毒外，大多数生物将其遗传信息储存在DNA分子中，功能的实现必须通过蛋白质•DNA通过自我复制将遗传信息代代相传，并通过RNA将其传给蛋白质•利用DNA为模板合成RNA的过程叫转录•利用RNA为模板合成蛋白质的过程叫翻译Foundedin1895逆转录•以RNA为模板在逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）催化下合成DNA的过程成为逆转录•逆转录和逆转录酶的发现，实现了以真核mRNA为模板，通过逆转录而获得为特定蛋白质编码的基因•利用逆转录酶所建立的cDNA文库为基因的分离和重组提供了重要手段Foundedin1895基因工程概要•基因工程又称DNA重组技术，是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，其实施的四个必要条件是：工具酶，基因，载体，受体细胞•基因工程的特征–外源核酸分子在寄主生物中能够表达–确定的DNA小片段在寄主细胞中能够大量扩增•基因工程包括基因的分离、重组、转移以及基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程Foundedin1895基因工程的实验步骤•带有目的基因的DNA片段的获取•在体外将带有目的基因的DNA片段连接到载体上，形成重组DNA分子•重组DNA分子导入受体细胞•带有重组体的细胞扩增•重组体的筛选Foundedin1895基因工程工具酶•把DNA分子切割、DNA片段修饰和DNA片段连接等所需的酶成为工具酶•根据其用途可分为三大类–限制性内切酶：识别和切割dsDNA分子内特殊核苷酸顺序的酶，通过水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，将完整的DNA分子切开–连接酶：将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶，催化磷酸二酯键的形成–修饰酶：包括DNA聚合酶、逆转录酶、T4多核苷酸酶、碱性磷酸酶等Foundedin1895限制性内切酶的作用Foundedin1895T4DNA酶的连接原理Foundedin1895基因工程载体•能够独立于宿主细胞染色体之外复制的DNA片段即是载体•载体能将外源DNA片段带入受体细胞，并决定外源基因的复制、扩增、传代乃至表达•常见的载体有质粒和病毒•天然质粒和病毒要加以改造，增加耐药性基因片段，以利于提高基因的转化、筛选和表达效率Foundedin1895载体的必备条件•能够进入宿主细胞：个体小，不具备独立生存的能力•在宿主细胞中能够独立复制，即本身是一个复制子：插入外源DNA片段的大小和数量不能破坏载体的复制能力，载体要实现多拷贝•要有筛选标记：抗药性•对多种限制酶有单一或较少的切点•随着DNA重组技术的改进，引入外源DNA进入宿主的方法有改进，已经突破了原有的大小限制；选择标记也可以被杂交技术、免疫学技术等替代Foundedin1895载体的分类•克隆载体：是以繁殖DNA片段为目的的载体，复制力强，拷贝数高•穿梭载体：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖，具有真核和原核两种复制点，常用于真核生物DNA片段在原核生物中的繁殖，然后再转入真核细胞宿主•表达载体：能够在宿主中进行高效表达•理想情况：拷贝数高，具有强启动子和稳定的mRNA，具有高的分离稳定性和结构稳定性，转化频率高，宿主范围广，插入外源基因容量大而且可以重新完整的切除，复制与转录应和宿主相匹配，最好是可调控的，而且在宿主不生长或低生长速率的情况下，仍能高水平的表达目的基因Foundedin1895常用的载体•质粒：环状双链小型DNA分子，可用于细菌细胞，也可用于动植物细胞•噬菌体：常用于细菌细胞•病毒：常用于动物细胞•粘粒：由质粒和噬菌体结合构建成的一种大容量克隆载体Foundedin1895用于原核生物宿主的载体——质粒•质粒是能自主复制的双链环状DNA分子，在细菌中独立于染色体存在，其复制和遗传独立，但依赖于宿主所编码的蛋白质和酶pUC19的结构图谱pBR322的结构图谱Foundedin1895外源基因克隆如质粒载体的过程Foundedin1895用于原核生物宿主的载体——噬菌体•噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线形等多种形式、大小不一的DNA，且感染率高•λ噬菌体含有线性双链DNA分子，两端有互补粘性末端，进入宿主细胞后可连接成为环状分子；属温和噬菌体，λDNA可整合到宿主细胞染色体DNA上，随染色体复制而复制；可承载较大的外源DNA片段；宿主细胞中有大量供噬菌体包装用的壳蛋白；有多个限制性内切酶的识别序列Foundedin1895λ噬菌体Foundedin1895用于真核生物宿主的载体——人工载体•具有大肠杆菌质粒的抗药性和噬菌体的强感染力，同时能够携带真核生物大片段DNA的目的基因•如柯斯质粒载体（粘质粒载体），既可按质粒载体的性质转化受体菌，并在其中复制，又可以按照λ噬菌体性质，进行体外包装转导受体细胞Foundedin1895用于真核生物宿主的载体•大多是穿梭质粒，既可在原核细胞中复制扩增，也可以在真核细胞中扩增、表达•酵母质粒：来自酿酒酵母•人工染色体载体：能够承载更大的外源基因–酵母人工染色体：在酵母细胞中克隆外源DNA大片段克隆体系，外源DNA容量为1000kb–细菌人工染色体：以细菌F因子为基础组建的细菌克隆体系，外源DNA容量为300kbFoundedin1895用于植物宿主的载体•由于植物细胞的特殊性，外源基因导入植物细胞的方法十分有限–Ti质粒：能够进入植物细胞并能整合到植物染色体DNA分子中，但其分子太长、限制性酶切位点多，易导致宿主产生不分化的不良植株–植物DNA病毒：宿主范围窄，可插入片段短，易丢失，插入外源DNA后感染力下降，使用很少–植物转座子：在生物体基因组中可从一个基因座位转移到另一个基因座位，有望成为新的植物载体Foundedin1895用于动物宿主的载体•哺乳动物细胞用于外源DNA表达采用的载体很有限，主要是猿猴空泡病毒40（SV40）•含双链环状DNA，只能插入2.5kb的外源基因•感染宿主主要为猴细胞，容易产生有危险的野生型•RNA病毒、痘病毒、人腺病毒、乳头瘤病毒等也可用于动物宿主的病毒载体Foundedin1895原核生物目的基因的获得•基因库的构建：将总DNA酶解获得包含所有基因的DNA片段集，将每一个片段与载体连接并分别导入受体细胞，可得到所有的包含该生物体全套基因的库Foundedin1895•基因文库的筛选通过免疫反应筛选通过DNA分子杂交筛选Foundedin1895真核生物目的基因的获得•cDNA文库的建立：细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和基因组DNA文库及cDNA文库组建图Foundedin1895•DNA的化学合成：把新的脱氧核糖核苷酸加到DNA双链的5’端，与细胞中DNA分子合成的方向相反；目前常用的是磷酰胺法•PCR法：体外通过酶促反应快速扩增特异DNA片段–有与被分离的目的基因两条链各一端序列互补的DNA引物–具有热稳定性的酶–dNTP作为底物–有作为模板的目的DNA序列Foundedin1895目的基因的转移•重组DNA进入受体的过程叫转化，得到重组DNA的细胞叫受体细胞•选择合适的受体细胞：转化效率高、稳定传代、易筛选、外源基因可高效表达和稳定积累；原核生物如大肠杆菌，真核细胞如酵母菌和枯草芽孢杆菌•选择合适的载体：具有强启动子、便于连接、适合受体细胞•选择合适的导入方法：氯化钙导入法、电穿孔法、噬菌体导入法、其他方法Foundedin1895重组体的筛选•传统生物学方法–遗传学方法：抗性筛选——插入失活检测，直接筛选；营养缺陷互补筛选——蓝白筛选–免疫学方法：有目的蛋白的抗体–利用噬菌斑筛选•核酸杂交法：利用放射性同位素标记的DNA或RNA作探针进行核酸杂交，进行重组体的筛选与鉴定–原位杂交–点杂交–Southern杂交（印迹技术）Foundedin1895利用抗生素抗性基因筛选重组体Foundedin1895原位菌落杂交筛选Foundedin1895Southern杂交原理Foundedin1895DNA序列分析•Maxam-Gilbert化学降解法–用特异的化学试剂修饰DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断多核苷酸链，通过凝胶电泳分离不同长度的寡核苷酸，对照四组不同反应所产生的电泳带的位置，读出序列–一轮反应只能测定约250bp的序列•Sanger双脱氧法（酶法）–加入双脱氧核苷酸后，DNA链的合成终止，将随机终止的和全合成的DNA链进行电泳分离，可确定碱基的分布–确定A、G、C、T四种碱基的全部序列–光学检测，适用于自动测序Foundedin1895Maxam-Gilbert法测序原理及G反应Foundedin1895双脱氧核苷酸的结构及其终止DNA合成Foundedin1895Sanger双脱氧测序法Foundedin18952基因工程在环境污染治理中的应用•合成有机化合物难于生物降解或降解缓慢•基因工程通过改变细胞内的关键酶或酶系统，可以–提高微生物的降解速率–拓宽底物的专一性范围–维持低浓度下的代谢活性–形成降解有毒污染物的新型催化活性–改善微生物的生