外泌体科学研究策略与方法

外泌体研究策略目录一、外泌体概述二、外泌研究兴起三、外泌体基础研究技术四、外泌体研究策略基本逻辑五、外泌体研究实例外泌体概述Exosome是直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡。Exosome天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌体(Exosome)是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。TanAAdvanceddrugdeliveryreviews,2013,65(3):357-367.外泌体研究的兴起2018外泌体中标项目研究的主要癌症种类2018外泌体中标项目机制研究涉及的主要非编码RNA种类2018外泌体中标项目的主要外泌体来源外泌体研究基础技术1、外泌体分离1）超速离心2）磁珠免疫捕获3）沉淀或过滤法，2、外泌体鉴定与定量1）鉴定：电镜或NTA来分析其大小和形态，流式细胞仪或WB检测表面标记蛋白，Westernblot和ELISA检测TSG101、CD63。2）定量：NTA检测外泌体数量，BCA定量检测蛋白浓度。3、外泌体功能研究1）荧光标记外泌体检测外泌体进入细胞2）常规实验：外泌体处理细胞检测功能3）WB/qPCR/荧光标记技术检测外泌体中发挥关键作用的生物分子在受体细胞胞核、胞质以及外泌体中的表达。外泌体研究策略基本逻辑JournalofHematology&OncologyDecember2015,8:83外泌体研究的本质：供体细胞对受体细胞的功能影响，通过外泌这个介质发挥作用外泌体研究基本路线图相互作用的受/供体细胞的选择供体细胞外泌体分离和鉴定外泌体对受体细胞功能的影响外泌体能够影响受体细胞功能的因素：细胞因子、mRNA、lncRNA、miRNA、circRNA以及其他。外泌体研究整体研究策略1、通常来说只要是涉及到两种不同细胞甚至同一种细胞的两种不同状态：癌与正常细胞（癌转化与抑制）、干细胞与高分化细胞损伤与修复）以及功能状态细胞与非激活状态细胞，就可以设计外泌体研究方案。2、外泌体研究关键点：参与外泌功能的关键生物分子——细胞因子、mRNA、lncRNA、miRNA、circRNA以及其他。3、外泌体设计基本思路有：关键生物分子到外泌体或外泌体到关键生物分子。但无论怎样其核心无法改变一定或有效应受体（供体有时会忽略，例如血清来源外泌体等实例一由生物分子到外泌体Exosome-TransmittedlncARSRPromotesSunitinibResistanceinRenalCancerbyActingasaCompetingEndogenousRNA1、lncARSRIsHighlyExpressedinSunitinib-ResistantRCCCells2、lncARSRIsModulatedbyAKT/FOXOAxisinSunitinib-ResistantRCCCells3、lncARSRIsRequiredforSunitinibResistanceofRCC4、lncARSRLevelsinPlasmaandTumorTissuesCorrelatewithSunitinibResponseinRCCPatients5、PackagingoflncARSRintoExosomesIsMediatedbyhnRNPA2B16、IntercellularTransferoflncARSRbyExosomesDisseminatesSunitinibResistance7、AXLandc-METAreResponsibleforlncARSR-MediatedSunitinibResistance8、lncARSRFunctionsasaceRNAformiR-34andmiR-449toFacilitateAXLandc-METExpression9、TargetinglncARSRRestoresSunitinibResponseinRCC总结：这篇文章中外泌体不是主角，外泌体只是作为长非编RNA功能作用机制的一个重要方面，但总体上给我们展现了外泌体研究的一系列重要方法：1）外泌体功能探讨的基础：供体细胞（舒尼替尼抗性肾癌细胞）/受体细胞（舒尼替你敏感性肾癌细胞）。2）外泌体功能前期预实验：功能生物分子位于外泌体中（图5A）、外泌体电镜检测（图5B）、不同来源外泌体中功能分子的差异表达（图5C）、功能分子被特异包裹入外泌体的关键蛋白检测（图5D）。3）外泌体功能实验：外泌体处理细胞、外泌体进细胞核以及受供体细胞共孵育等。实例二由外泌体到生物分子Endothelialmicroparticlesmediateinflammation-inducedvascularcalcification1、TNF-aup-regulatesECBMP-2expressionthroughactivationofNF-kBandstimulatesthegenerationofEMPs2、AnnexinV,calcium,andBMP-2inEMPsfromHUVECsstimulatedbyTNF-aBMP-2表面标记流式检测；SN50nf-kb抑制剂3、TheeffectofEMPsfromHUVECsstimulatedbyTNF-aonVSMCcalcificationA：vs.NP;b：0.05vs.HPplusControl-EMP;c：vs.HPplusTNF-aEMP.HP高磷、SN不含外泌体上清4、KnockdownofBMP-2inHUVECsproducesnonmineralizingTNF-a-EMPs5、EMPsfrompatientswithCKDstimulateVSMCcalcificationandosteogenesisAndfromsenescentHUVECsinducecalcificationandosteogenicchangesofVSMCs6、InternalizationofEMPsbyVSMCs实例三CD90+livercancercellsmodulateendothelialcellphenotypethroughthereleaseofexosomescontainingH19lncRNA1、CD90+cellsshowamesenchymalphenotypeandactivelyreleaseexosomes2、ExosomesreleasedbyCD90+Huh7cellsaffectHUVECsbypromotingtubeformationandcell-celladhesionICAM-1细胞粘附因子3、CD90+cellsexpressthelncRNAH19andreleaseitviaexosomes4、LncRNAH19stimulatesangiogenesisandpromotestheadhesionofCD90+Huh7cellstoendothelialcellmonolayer