PCR技术概述-PPT课件

1PCR技术2PCR（PolymeraseChainReaction)技术即聚合酶链反应，又称DNA体外扩增技术。1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明的一种具有划时代意义的分子生物学技术，被誉为无细胞分子克隆。3一、PCR技术的创建Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1985年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。4三篇重要论文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)5引物引物1983年Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段694℃变性50-65℃退火XX℃延伸7DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，缺点：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加入。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。81988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。91988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。10TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402011二、PCR技术的原理1PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。12体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类引物5’3’知识点回顾13加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。14PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火152PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍162）特异性引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物引物173’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记183）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位素探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。19目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子204）对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用各种生物标本（如血液、体腔液、毛发、细胞、活组织等）粗制的DNA扩增检测。215）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学22三、PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。23总体积50-100lBuffer缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶1反应体系24PCR技术的基本过程(1)模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC2基本过程25PCR技术的基本过程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min26琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)27（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3PCR反应条件28（2）引物Ⅰ引物合成的质量PCR所用引物质量较高，且需纯化。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高效液相层析纯化，减少发生非特异扩增和信号强度的降低。冻干引物于-20℃可以保存12-24个月，甚至更长，液体状态-20℃可以保存6个月或更长。29Ⅱ引物设计的一般原则（1)引物长度特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。长度以15-40bp为宜。引物长度增加，能提高特异性，但在退火时被引发的模板会减少，降低反应效率。实际应用中最适延伸温度不要超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃）。30（2）引物的3‘末端和5’末端核苷酸引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3‘端也不能发生错配；5’端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，可以被修饰。31（3）GC的含量一对引物的GC含量和Tm值应该协调，G+C一般占40-60%。根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,可估计引物的Tm值。32（4）两引物间避免有互补序列，尤其避免3’端的互补重叠。一般来讲，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。33（5）碱基的随机分布选择缺乏连续单一核苷酸的区域作为引物序列，这样可以减少引物-引物同源互补的机会。也要注意引物在长度和碱基组成上的平衡，两个引物的Tm值相差2-3℃范围内。34（6）引物内部避免形成二级结构。采用计算机软件可以预测估计mRNA的稳定的二级结构，有助于选择模板。35Ⅲ引物浓度0.1-1mol/L引物浓度过低，PCR产物量下降。浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降，还会增加引物二聚体的形成。非特异性产物和引物二聚体又可作为PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP底物，使靶序列的扩增量降低。36（3）循环参数Ⅰ变性的时间与温度不同的DNA解链温度不同，由于DNA中GC与AT的比例不同引起的。GC比例越大，解链温度越高。一般GC含量每增加1%，解链温度就增加0.4℃。典型的变性条件是95℃30s或97℃15s。37过高使聚合酶失去活性，过低DNA变性不完全。变性温度在90-95℃时，既能保证使DNA双链模板变性，又能保持Taq聚合酶活力。因此PCR变性温度在90-95℃之间选择，时间为30-60s。38Ⅱ退火时间与温度退火温度决定着PCR的特异性。引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度。范围一般在25-65℃，低于引物Tm值5℃左右。在典型的引物浓度时，退火时间一般为40-90s，过短会导致引物与模板DNA互补配对失败。39Ⅲ延伸时间与温度延伸时间的长短取决于待扩增的模板序列的长度与浓度，以及延伸温度高低。引物延伸在70-74℃下进行，根据扩增DNA的长度而确定，一般延伸30-90s。40Ⅳ循环次数的确定以既达到扩增效果又尽量减少非特异性产物的扩增为原则，PCR的循环次数一般在25-35次。循环系数过多将增加非特异产物；循环次数太少，产率偏低。因此在得到足够产物的条件下应尽量减少循环次数。41经典循环参数（500bp以内）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min4℃forever42（4）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus0.5-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。催化DNA合成的温度以70-80℃为宜。高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。43（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度，可适当提高Mg2+的用量。44（6）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度，一般为50-200umol/L;四种dNTP浓度应相等,过高或过低导致错误渗入增加，终止反应；浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。45（7）其他辅助试剂加入一定浓度的添加剂如DMSO（二甲基亚砜）、甘油或甲酰胺等，可提高PCR扩增效率及特征性。可能是消除了引物和模板的二级结构，降低DNA双链的解链温度，使DNA双链完全变性所致。还可加入牛血清白蛋白、明胶、Tween20或二硫苏糖醇（DTT），有助于酶的稳定。461）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。四、PCR的类型472)反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列48已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶493）多重PCR（复合PCR）在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.50用于检测特定基因序列的存在或缺失。或用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管