第七章 含锌蛋白和含锌酶

第七章含锌蛋白和含锌酶第一节概述第二节锌肽酶第三节碳酸酐酶第四节核酸酶第五节锌指蛋白第六节金属硫蛋白Bothzincandmagnesiumionsarethoughttoactivatesubstrateandnucleophilicwatermolecule,whichlosesproponandturnsintohydroxylion.Theschemeisverysketchy,additionalresiduesmaybeinvolved.Biochemistry.(2003).42(45),13220-6.Amechanismforphosphodiesterasecatalysis水解酶（hydrolase），六大酶类之一，催化水解反应的酶；也可以说它们是一类特殊的转移酶，用水作为被转移基团的受体。A–B+H2O→A–OH+B–H水解酶（hydrolase）是六大酶中研究得最多应用最广泛的一类。根据水解键的类型分为肽酶(peptidase)、酯酶(esterase)、糖苷酶(glycosidase)等多个亚类。不少水解酶的活性与金属离子有关；水解金属酶中很多与Zn2＋有关，其次是Ca2＋、Mg2＋，还有少数酶含Mn2＋，Ni2+。水解过程不发生电子转移，所以金属离子的氧化态在催化过程中不变化。第一节概述水解胞外酶氨基酸吸收入外源蛋白质作用于肽键——肽酶（蛋白质的水解）作用于酯键,使其水解为酸和醇——酯酶作用于糖基化合物——糖苷酶作用于酸酐——酸酐酶作用于醚键——醚酶作用于其它的C－N键——C-N酶根据水解键的类型，水解酶分为：水解酶的类型酶催化反应金属离子羧肽酶亮氨酸氨肽酶二肽酶中性蛋白酶胶原酶磷脂酶Cβ-内酰胺酶II嗜热菌蛋白酶碱性磷酸酯酶碳酸酐酶α-淀粉酶磷脂酶A无机焦磷酸酶氨肽酶ATP酶Na+,K+-ATP酶脲酶C-末端肽残基水解亮氨酸N-末端肽残基水解二肽水解肽水解胶原水解磷脂水解β-内酰胺水解肽水解磷酸酯水解CO2水合葡萄糖苷、糖苷水解磷脂水解焦磷酸→正磷酸N-末端肽残基水解ATP水解ATP水解与阳离子运送尿素分子水解Zn2+Zn2+Zn2+Zn2+，Ca2+Zn2+Zn2+Zn2+Zn2+，Ca2+Zn2+Zn2+Ca2+，Zn2+Ca2+Mg2+Mg2+，Mn2+Mg2+Na+，K+Ni2+某些水解金属酶和金属离子激活酶水解酶中的金属离子水解金属酶中很多与Zn2＋有关，其次是Ca2＋、Mg2＋，还有少数酶含Mn2＋，Ni2＋。水解过程不发生电子转移，所以金属离子的氧化态在催化过程中不变化。Zn2＋、Ca2＋、Mg2＋等金属离子不具有为充满电子的d轨道，应用EPR,Mössbauer,d-d电子光谱研究有困难，通常采用适当的其它过渡金属离子以取得必要的信息。常采用Co2＋代替Zn2＋，Mn2＋代替Mg2＋。为了成功地使用一个探针金属离子，必须遵循同晶置换的原则，即探针离子在酶分子中占据原有金属离子所在的同一位置。还要考虑电子构型、离子半径、配位几何等因素。关键问题在于能否继续保持酶分子的生物活性。某些金属离子探针金属酶中的金属离子探针金属离子探针的检测技术名称半径/pm名称半径/pmK+133Tl+140NMR，荧光Mg2+65Mn2+88EPRNi2+69d-d光谱Ca2+99Mn2+88EPRZn2+69Co2+82d-d光谱Zn(II)配合物与类似的二价阳离子配合物的几何构型金属离子dn半径/pm有利构型（可能构型）Zn2+d1069四面体（八面体，四方锥）Co2+d782四面体、四方锥、八面体Fe2+d692八面体（四面体）Ni2+d868八面体、平面正方Cu2+d972平面正方（假四面体）Cd2+d1083八面体Ni2+和Cu2+的半径与Zn2+最近接，但几何配位构型与Zn2+配合物不同。Zn2+配合物多采取四面体配位，Ni2+和Cu2+配合物通常采取八面体和平面正方形构型。虽然Co2+半径和电子组态与Zn2+有一定差异，但其配合物有多种几何构型。锌的概述Zn是生物体中第二个丰富的过渡金属，在生物学中锌的重要性仅次于铁。锌在生物体内几乎都以Zn2+形式存在。Zn有较强的吸引电子的能力，是一个强的Lewis酸，可广泛地与蛋白质中的某些氨基酸残基的咪唑氮原子，巯基硫原子，羧基氧原子等通过配位键形成配位数低的键合中心；在生理条件下不会被氧化或还原，因此Zn能在氧化还原电位不断变化的生物介质中始终保持Zn2+阳离子状态;Zn2+的构型是柔性的，易发生单配体取代反应；Zn2+其它离子相比，Zn2+的毒性非常低，且生物体对锌的摄取，排除与体内分配的调节机制一般都非常有效，所以很少出现锌中毒现象。由于锌具有这些独特的优越性，因此锌广泛地参与蛋白质，酶，核酸，糖类，脂类的代谢与基因转录的调控等最基本最重要的生化过程。Zn2+在锌酶或蛋白中主要发挥催化和结构调控功能；具有结构功能的Zn2+中心和具有催化功能的Zn2+中心之间最大的区别是，与后者配位的H2O分子在前者中通常被一个氨基酸残基取代,从而增强前者Zn2+中心配位结构的稳定性。有时具有结构功能的Zn2+可以转化为具有催化功能的Zn2+。蛋白质为高分子物质，不能透过细胞膜，必须水解成小分子才能被肠吸收。蛋白质由各种肽酶催化，水解成小分子，被肠吸收。蛋白质中肽键的水解非常缓慢，在生理条件下，其水解半衰期为10~1000a。天然肽酶几乎无一例外地含有Zn(II)。锌肽酶大约可以分为五组,共30几个成员,其中羧肽酶A(carboxypeptidaseA,CPA)和嗜热菌蛋白酶(thermolysin)研究得最清楚，最广泛，因此他们被作为锌蛋白酶的代表。近年来越来越多的锌肽酶的结构被测定，使有关结构与生物功能关系的研究取得了新的进展。第二节锌肽酶羧肽酶A，carboxypeptidaseA，CPA羧肽酶A是水解由芳香族和中性脂肪族氨基酸形成的羧基末端。比如酪氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸等。羧肽酶A存在于哺乳动物胰脏(pancreas)中，相对分子质量34,600，每个酶分子含有一个Zn2+作为辅基，酶蛋白为单一的多肽链，约有300个氨基酸残基。每个酶分子都有一条窄长的空腔，这是底物的结合位置。底物的C末端沿着这条沟槽深入到酶分子内的活性部位，空腔内还有一定数量的水分子。CPAactivesiteofCPAZn2+是酶活性所必需的组分。与His69,Glu72和His196配位，第四个配位位置是一个结合力很弱的水分子。这个H2O分子还与Glu270之间存在氢键作用。Zn2+除了直接与氨基酸残基配位外，Arg145,Tyr248,Glu270的侧链基团也参与与底物的结合，这对酶的催化活性至关重要。在活性中心，底物与羧肽酶A以各种弱相互作用结合，生成中间产物。(a).酶的带正电荷的精氨酸(Arg)–145的胍基(guanidinegroup)和底物的带负电荷的C–末端羧基互相吸引;（静电相互作用）(b).底物的酪氨酸残基的芳基侧链进入酶的非极性口袋形空腔中;（疏水作用）(c).底物敏感肽键的–NH–基上的氮原子与酶的酪氨酸(Tyr)–248的–OH以氢键连结;（氢键作用）(d).底物肽键上的羰基挤走了水分子而与Zn2+配位；（配位键作用）(e).底物末端的羰基碳原子通过1个插入的水分子与酶的谷氨酸(Glu)–270的侧链以氢键连结。（氢键作用）X射线结构分析发现，羧肽酶A与酪氨酸残基的结合过程必须通过活性中心的重排，特别是酶分子的构象的重大改变才能实现。首先，结合底物时Arg145和Glu270移动了0.2nm。Arg145的位移带动了肽链的扭转，使Tyr248移动了1.2nm。这个距离相当于整个酶分子直径的1/4。酪氨酸残基Tyr248的酚基从酶的表面移到底物的肽键附近，方向也有向上变为向下。酶与底物结合之后可能的机理是：谷氨酸残基Glu270激活了水分子，提高了水分子中氧的亲和力，后者向底物肽键羰基的碳原子进攻，然后谷氨酸残基Glu270的羰基质子化。与此同时，酪氨酸残基Tyr248提供一个质子，肽键断裂，底物分解。该过程中，Zn2+起了使肽键产生张力的作用，从而促进了底物的水解。酶与底物结合后，由于Zn2+的作用，底物肽键的羰基原子的电子云密度降低而呈正电性，因此，羰基碳原子更容易接受亲核进攻。嗜热菌蛋白酶(thermolysin)嗜热菌蛋白酶是从耐热微生物的培养基中分离出来的细胞外中性蛋白酶。它的功能是切断蛋白质分子中的肽键，使之变成小分子多肽。单一的肽链上有316个氨基酸残基，含有1个Zn2+和4个Ca2+。分子中部有一条口袋形空腔，Zn2+就在这个空腔内。Generalstructureofthermolysin(PDBID3DNZ).Zn2+ioninyellow;Ca2+ionsingreen.晶体结构分析表明，Zn2+处于五配位状态，与His142,His146,Glu166和一个水分子结合，这与羧肽酶中Zn2+的配位状态十分相似。4个Ca2+有2个相距0.38nm，另外2个相距较远。其热稳定性非常好，80C加热1h，仍保持50%活性。Ca2+是嗜热菌蛋白酶具有较高热稳定性的因素之一。嗜热菌蛋白酶与底物结合时，Zn2+处于五配位状态，底物并不取代与Zn2+配位的分子，待切断肽键的羰基作为第五配体与Zn2+配位而使羰基极化，同时与Zn2+配位的H2O分子接近的Glu143的羧基。Glu143质子化后，与Zn2+配位的OH-向羰基碳原子发动亲核进攻。随后His231给出1个质子，使肽键上的氮原子带正电荷。最后C-N键断裂生成产物。第三节碳酸酐酶,Carbonicanhydrase,CA1940年发现的第一个锌酶，也是最重要的锌酶。碳酸酐酶是红细胞的主要蛋白质成分之一，在红细胞中的地位仅次于血红蛋白。碳酸酐酶广泛存在动物、植物及微生物中。人体内，在红细胞、肺泡、破骨细胞、肾小管、脑、胰腺、胃粘膜、食管、骨骼肌、视网膜及睫状体等几乎所有组织及细胞类型中，与人体酸碱平衡、青光眼、骨质疏松症、癌症等多种生理或病理过程密切相关,多年来一直备受关注。在没有催化剂的情况下,CO2和HCO3-的转换非常慢，而碳酸酐酶的存在可以使CO2水合和脱水反应的速度分别加快13000倍和25000倍。碳酸酐酶是已知金属酶中催化转换数最高的之一。它可以在2ms内使95%得CO2转换为HCO3-，即:CO2+H2O↔HCO3-+H+在哺乳动物中，碳酸酐酶有11种同功酶。其中以人碳酸酐酶II，III(HCAII,HCAIII)，和牛碳酸酐酶II(BCAII)研究最多。这三种碳酸酐酶的一级结构分别含有260，259，264个氨基酸残基，其中脯氨酸含量最高。不含二硫键，由单一肽链组成，每个分子含有一个Zn2+离子。碳酸酐酶最重要的生理功能是催化二氧化碳的水合作用。在人和动物体内，由碳酸酐酶催化CO2水合生成HCO3-，当HCO3-随血液循环到肺泡后，又由碳酸酐酶催化使它分解为CO2排出体外。碳酸酐酶除了选择性的识别CO2和HCO3-作为催化底物和产物，也可以催化磷酸酯，羧酸酯酯类的水解。碳酸酐酶的结构和催化机理碳酸酐酶分子有一个袋形口袋空腔，深约1.5nm，腔口宽约2.0nm，Zn2+就结合在这个空腔底部。在碳酸酐酶的活性中心，由三个组氨酸残基和一个水分子或氢氧根离子配位，形成一个畸变的四面体结构。在配位原子附近的氨基酸Thr199与Glu106组成一个氢键网络稳定His3Zn-OH结构;由Val143,Val121,Trp209,和Leu198构成一个疏水口袋，其功能被认为是将CO2固定在在疏水空腔内，从而使His3Zn-OH对CO2直接进行亲核进攻。碳酸酐酶中配位水分子的pKa值大约为6.8，对催化功能特别重要。如果把水分子从第四配位点取代，碳酸酐酶的催化活性会受到抑制。常见的碳酸酐酶抑制剂包括：卤素离子，羧酸根离子，酚，醇，咪唑，羧酸酰胺，硫酰胺，硫氰酸根等。这些分子或离子能不同程度的抑制碳