环境工程微生物学实验指导(1.12修改)(1)

环境工程微生物学实验指导西北师大地环学院环境科学与工程系巨天珍教授环境工程微生物学实验指导书授课对象：环境科学专业课程类型：必修学时数：36学时学分数：2先修课程：环境工程，水污染控制工程。基本要求：1、课前预习了解清楚实验的目的、原理和试验内容，需测试项目的测试方法，实验中应注意的问题并于实验前提交预习报告。2、实验操作实验前要熟悉实验设备，了解操作要点，实验中严格按操作要求认真操作，仔细观察实验现象，精心测定和详细记录实验数据。3、实验数据整理通过实验取得大量数据后，必须对数据进行科学地分析整理，去伪存真，去粗存精，以得到正确、可靠的结果。（这一部分往往被忽视，应重视对实验结果的分析，引导学生查阅文献，进一步验证实验过程的可靠性，激发学生对未知规律探索的兴趣）实验项目总表实验项目名称项目类别项目类型项目学时数培养基的制备及灭菌基础性必做2微生物形态观察（菌落特征的观察）基础性必做4细菌的简单染色基础性必做4革兰氏染色法基础性必做4土壤微生物的检测综合性必做8水质的细菌学检测设计性必做4空气微生物的检测设计性选做4植物基因组DNA的小量提取方法综合性必做2聚合酶链式反应（PCR）综合性必做2DNA琼脂糖凝胶电泳综合性必做4实时荧光定量PCR的使用综合性必做2目录实验须知.....................................................................................................................................1实验1培养基的制备与灭菌....................................................................................................2实验2微生物的形态观察........................................................................................................4实验3细菌的简单染色............................................................................................................6实验4革兰氏染色法................................................................................................................9实验5土壤微生物的检测......................................................................................................11实验6水质的细菌学检测......................................................................................................16＊实验7空气微生物的检测..................................................................................................20实验8植物基因组DNA的小量提取方法............................................................................22实验9聚合酶链式反应（PCR）..........................................................................................24实验10DNA琼脂糖凝胶电泳.............................................................................................26实验11实时荧光定量PCR的使用......................................................................................28参考文献...................................................................................................................................29附录1常用玻璃器皿的洗涤与包扎......................................................................................30附录2普通光学显微镜的使用..............................................................................................34附录3相差显微镜..................................................................................................................38附录4菌种的保藏..................................................................................................................40附录5培养基配方..................................................................................................................42附录6几种主要染色液的配制..............................................................................................44附录7常用试剂、溶液的配制..............................................................................................451实验须知普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成事实求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的良好作风。在微生物学实验过程中，学生和老师会经常接触水电、病原微生物以及其他危险品。为了保证安全，规范操作，勤俭节约，特提出如下注意事项。1.实验前的准备（1）为了保证实验室的整洁和实验顺利进行，非必要的物品包括书包，请勿带入室内。（2）准备好实验工作服和必要的实验用具、留头发者须将头发扎起，做好必要的清洁工作。（3）实验前必须预习实验内并做好预习报告，了解实验目的、原理和方法，做到心中有数，思路清晰。（4）按实验要求准备好培养基、菌种和必要的试剂。2．实验过程中的注意事项（1）实验室内严禁饮食和吸烟。实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。（2）一切易燃品，如乙醇、乙醚、丙酮等，应远离火源，不可将酒精灯倾向另一酒精灯引火。电炉、煤气等用完后应立即关灭。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。（3）实验小心仔细，操作严格谨慎，预防感染。用过的棉球、纱布等污物，放在固定容器中，统一处理，不得随意抛弃。如不慎将菌液洒到桌面或地面，应以5%石碳酸溶液或3%来苏尔溶液覆盖0.5小时才能擦去。如不慎将菌液吸入口中或皮肤破伤处或烫伤，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。（4）实验进行培养的材料，应注明组别、名称及处理方法，放于教师的地点进行培养。（5）认真、及时做好实验记录，不可潦草应付。对于连续观察的实验，则需记下每次观察的时间、现象和结果。（6）实验室中各物均应摆放一定位置，工作完后放回原处或指定地点。（7）使用显微镜等仪器时，要求细心操作，按操作规程工作、保养，避免不必要的损耗和意外。金属器皿用完消毒后，应立即擦干，防治生锈。（8）使用药品、试剂、染色剂、镜油、擦镜纸、玻璃器皿等消耗品要力求节约。3．实验结束后的注意事项（1）实验完毕后，必须把所有仪器擦净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，对有菌液污染的地方进行必要的消毒，并用肥皂洗净自身的手。（2）菌种或种毒不得带出实验室，若要索取，应严格按照规章办理，其他物品未经教师许可也不得带出实验室。（3）离实验室前注意关闭火、煤气、门窗、灯等。最后一人离开实验室前，应检查一遍水、电、煤气，关好门窗。（4）每次实验结果，应以实事求是的态度填写实验报告，及时交给指导教师进行批阅。2实验1培养基的制备与灭菌目的要求1．学生熟悉玻璃器皿洗涤和灭菌前的准备工作。2．掌握培养基和无菌水的制备方法。3．了解高压蒸汽灭菌的原理及应用范围。4．学习高压蒸汽灭菌的操作方法。5．了解干热灭菌和紫外线灭菌。6．区别消毒与灭菌。一、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。干热灭菌、高压蒸气灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。高压蒸气灭菌时，将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过持续加热，使水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不外逸，容器内气压上升，水的沸点随之提高，得到高于100℃的温度。这样，导致菌体蛋白质能故变性，从而达到灭菌的目的。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需要的温度高（160-170℃），时间长（1-2h）。但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长200-300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌能力最强。紫外线穿透力不大，一般只适用于无菌室、接种箱及物体表面的灭菌。消毒与灭菌的区别。消毒只要求清除致病微生物，使其数量减少到不再能引起人发病，灭菌不仅要求清除致病微生物，还要求将所有微生物全部清除，包括非致病微生物。二、实验器材高压蒸气灭菌锅、试管、培养皿等。三、实验内容1．培养基的制备培养基是微生物的繁殖基地，通常根据微生物生长繁殖所需的各种营养物配制而成，培养基的制备过程如下：（1）称量：一般可用1/100粗天平称量配置培养基所需要的各种药品。先按培养基配方计算各成分的用量，然后进行准确称量。（2）溶化：将烧杯中先加少量水（根据实验需要可用自来水或蒸馏水），体积约为所需体积的2/3，然后将称量好的药品依次加入该烧杯中。（3）定容：待药品全部溶解后，加水至所需体积。（4）调PH值：一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如加入培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液进行调节。2．平板的制作将装在锥形瓶的已灭菌的培养基溶化后，待冷却至50℃左右倾入无菌的培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多，温度低于50℃时，培养基易于凝固而无法制作平板。3平板的制作应在火旁前进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部，左手同时