第七章-微生物的遗传变异与育种

第七章微生物的遗传变异与育种第一节遗传变异的物质基础第二节基因突变和诱变育种第三节基因重组和杂交育种第四节基因工程第五节菌种的衰退、复壮与保藏理想的工业发酵菌种应符合以下要求：①遗传性状稳定；②生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；③目标产物的产量尽可能接近理论转化率；④目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；⑤尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离；⑥培养基成分简单、来源广、价格低廉；⑦对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；⑧对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。遗传与变异的概念遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；------是一种内在可能性或潜力。遗传型+环境条件表型表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;------是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。代谢发育变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点：a.在群体中以极低的几率出现，（一般为10-6～10-10）；b.形状变化的幅度大；c.变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。例如：粘质沙雷氏菌：在25℃下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37℃下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25℃，又恢复产色素的能力。遗传与变异的概念微生物的独特生物学特性：（1）个体的体制极其简单；（2）营养体一般都是单倍体；（3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；（4）繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多样性；（7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；（8）易于形成营养缺陷型；（9）各种微生物一般都有相应的病毒；（10）存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。研究微生物遗传学的意义第一节遗传变异的物质基础种质连续理论：1883－1889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。基因学说：1933年摩尔根（ThomasHuntMorgan）发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列核组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验），才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。1928年，Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活RII菌或死SIII菌————小鼠存活对小鼠注射活SIII菌————————小鼠死亡对小鼠注射活RII菌和热死SIII菌———小鼠死亡抽取心血分离活的SIII菌一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验（一）经典转化实验（transformation）：F.Griffith，研究对象：Streptococcuspneumoniae（肺炎双球菌）SIII型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性RII型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性Griffith转化试验示意混合培养RII型活菌SIII型活菌SIII型热死菌RII型活菌SIII型活菌健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死（2）细菌培养实验（3）S型菌的无细胞抽提液试验以上实验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型细胞。热死SIII菌—————不生长活RII菌—————长出RII菌热死SIII菌—————长出大量RII菌和10-6SIII菌活R菌+S菌无细胞抽提液——长出大量R菌和少量S菌+活RII菌平皿培养①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白质⑥加S菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S.pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。（二）噬菌体感染实验A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中10分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附离心沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性沉淀中含25%放射性以32S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中10分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附离心沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体上清液中含75%放射性（三）植物病毒的重建实验为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：（1）RNA（TMV）蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV）蛋白质（TMV）用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子（2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。（一）核酸存在的七个水平及质粒细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平:原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA染色体水平:倍性(真核)和染色体数核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录——翻译密码子水平：信息单位,起始和终止,核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式核外DNA的种类核外染色体真核生物的“质粒”原核生物的质粒线粒体细胞质基因叶绿体（质体）中心体动体共生生物：卡巴颗粒酵母菌的2m质粒F因子R因子Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒基因：能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA）的DNA序列。原核生物基因系统：启动子（基因）操纵子操纵子（基因）基因调控系统结构基因调节基因CABSummaryA:RNApolymeraseB:lacrepressorC:CRP-cAMP细胞水平：大部分或全部DNA都集中于细胞核或核质体中，不同种类微生物或同种不同细胞中细胞核的数目不同染色体水平：真核微生物的每个细胞核内含有一定数量的染色体；而原核微生物中一个核质体就是一个裸露的、光学显微镜下不能看到的环状染色体。一些真核生物和原核生物基因组的比较生物单倍体的分子量核苷酸已知染色体数约数（Da）对数基因数人323－5×10125－7×109－4000黑腹果蝇47.9×10108.0×1075000－6000粗糙脉孢菌72.8×10104.5×107500大肠杆菌12.5×1093.8×106－1027噬菌体T411.1×1082.0×105－135噬菌体13.2×1074.8×104－35噬菌体MS211.1×1063.5×1033遗传密码：指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序密码子（coden）：由3个核苷酸顺序决定，负载遗传信息的基本单位不对称转录：只有DNA双链的一股才作为有意义链被转录，这种现象又称不对称转录。起始密码子：AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸终止密码子：UAA、UGA、UAG质粒：细菌染色体外的遗传物质，由共价闭合环状双链DNA分子组成，能独立于细胞核进行自主复制。大小：分子量约为２—100×106D，携带1—100个基因,一个菌细胞可有一至数个质粒。质粒的特点：可自我复制，稳定遗传。对生存不是必要的。复制与染色体分开，但同步进行。不同质粒携带不同遗传信息。无质粒细菌可通过接合、转化、转导等方式获得，不能自发产生。例：细菌抗药性因子、大肠杆菌的F因子。质粒应用:基因工程，体外重组.三、原核生物的质粒1.特点：①可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在；②质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（1－5）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10－200个或更多。③可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。④对于细菌的生存并不是必要的⑤功能多样化三、原核生物的质粒2.质粒在基因工程中的应用质粒在基因工程操作中的优点：1.体积小，便于DNA的分离和操作；2.呈环状，在化学分离过程中能保持稳定性；3.有不受核基因组控制的独立复制起始点；4.拷贝数多，使外源DNA可快速扩增；5.存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克隆的检出和选择。E.Coli的PBR322质粒E.Coli的PBR322质粒的具体优点：1.体积小，仅4361bp；2.在宿主E.coli中稳定地维持高拷贝数（20－30个/细胞）；3.氯霉素抑制宿主蛋白质合成，则每个细胞可扩增到含1000－3000个质粒；4.分离极其容易；5.可插入较多的外源DNA（不超过10bp）；6.结构完全清楚，各种核酸内切酶可酶解的位点可任意选用；7.有两个选择性抗药标记（氨苄青霉素和四环素）；8.可方便地通过转化作用导入宿主细胞。功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcuslactis、根癌土壤杆菌等制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法3.质粒的分离与鉴定1.细菌的培养和收集将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/mlAmp)中,37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑