重组蛋白纯化SOP

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1.仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mMPBS或50mMTris-HClpH7.5；50ml离心管；冷冻高速离心机2.方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000r/min4℃离心15min，弃上清。2.1.2菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mMPBS或50mMTris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。2.1.3然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml,EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml）。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。2.1.4将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。2.2超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)2.2.1将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，直至菌体溶液变清澈为止。2.2.2取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。（4）可通过SDS-PAGE电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。2.3GST融合蛋白的纯化以PGEX融合表达载体表达的GST融合蛋白，可用谷胱甘肽－亲和层析介质纯化。GE公司的谷胱甘肽亲和介质是用10个碳原子连接臂和谷胱甘肽作为配体连接到4%交联的琼脂糖凝胶上，专门用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它的谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白的亲和色谱填料。1．GE公司谷胱甘肽填料的性质：基质4%的交联琼脂糖凝胶吸附载量10mgGST融合蛋白/ml亲和填料的颗粒大小90μm最大流速450cm/hpH范围3-12使用温度常温保存温度+4~30℃保存液体20%乙醇化学稳定性室温1M乙酸盐，6M盐酸胍条件下稳定1h实验过程中，可根据填料的吸附容量决定上样量，根据填料的其他特性保存填料2缓冲液及样品准备2.1缓冲液BindingBuffer：PBSpH7.3(140mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4)ElutionBuffer：50mMTris-HCl,10mM还原型谷胱甘肽，pH8.0注：如有需要，结合及洗脱液中可加入1-10mMDTT2.2样品样品上柱前要于10000rpm下离心10分钟或经0.45μm的滤膜过滤后才能上样。如果进行批量纯化时可不必过滤。若样品黏度较大，可用结合缓冲液适当稀释。3批量纯化3.1介质的准备(1)取1mlGST琼脂糖凝胶制成50%混悬液(2)用移液管转移到离心管里500×g离心5min，小心倾去上清。(3)加入5mlPBS混匀介质进行洗涤。(4)500×g离心5min沉淀介质，小心倾去上清。(5)重复洗涤一次。3.2批量纯化(1)向GST琼脂糖凝胶里加入细胞裂解液（根据目的蛋白表达量和介质的吸附容量决定上样量），轻轻混匀，使GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的充分结合，4度旋转孵育3小时（可进行实验确定）。(2)用吸管将混合物转移到另一离心管中，(3)500×g离心5min沉淀介质，小心倾去上清，取20μl上清液（即流穿液）进行SDS-PAGE以分析介质的结合效率。(4)加入5mlPBS混匀，洗涤。(5)500×g离心5min沉淀介质，小心倾去上清（洗涤液），取20μl上清液SDS-PAGE分析。(6)重复步骤4、5两次。(7)加入0.5mlElutionBuffer，轻轻混匀，室温孵育20min。(8)500×g离心5min沉淀介质，小心收集上清（洗脱液）。(9)重复步骤4、5两次，分别检测三次洗脱上清中目的蛋白的含量，根据结果合并含量较多的上清液。3.3注意事项(1)GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为了获得最大的结合量，很重要的一点就是保证足够作用时间。不同的GST融合蛋白结合效率会有很大不同。(2)对不同GST融合蛋白，洗脱体积和洗脱时间会有所不同，可能会需要更高浓度的还原型谷胱甘肽。如果需要的话，需要对流穿液、洗涤液及洗脱液进行SDS-PAGE以及Westernblot分析。(3)GST融合蛋白的浓度可以通过bradford法或紫外分光光度法来确定。如果用Lowry或者BCA分析，样品需要先利用脱盐柱或超滤进行缓冲液交换处理或透析处理。以除去其中的还原型谷胱甘肽，因为还原型谷胱甘肽的存在会干扰BCA和Lowry测定。(4)GST琼脂糖凝胶能否重复利用要根据样品来定，而且只能用来处理同一种样品，以防止交叉污染。4柱纯化4.1装柱(1)所有试剂耗材的温度应调整到纯化时的温度。(2)PBS脱气后从柱底下出口管朝柱内注入，使柱底全部充满水而不留气泡，柱底预留10%柱体积的缓冲液，关闭柱下端出口。(3)将洗好的介质用PBS重悬成60%的混悬液，轻轻搅动凝胶溶液，使形成均一的薄胶浆，并立即倒入层析管内，让加入的凝胶在柱内自然沉降。(4)立刻将层析柱用PBS缓冲液充满，装好柱上端接口并连接上蠕动泵。(5)打开柱子下端出口，并调高泵的流速为15ml/min，让介质在不高于1bar(0.1Mpa)的恒定压力下压紧。(6)当柱床体积恒定不变后继续以相同流速至少平衡3个柱床体积，并标记柱床高度（纯化过程中流速不得超过压紧介质流速的75%）。(7)停止蠕动泵，柱内液面缓慢下降，直到稍高于凝胶界面，关闭柱下端出口。柱下端出口连接上细塑管。4.2柱纯化(1)介质平衡：用10倍柱床体积的BindingBuffer平衡柱子，流速1ml/min。或一直平衡直到紫外检测仪基线走平。(2)上样：关紧螺旋夹，用毛细吸管小心吸去凝胶层面上的缓冲液至凝胶层面与缓冲液液面齐平。将样品离心或过滤后，用吸管小心沿柱壁缓缓加入柱内。轻开螺旋夹，使柱中缓冲液缓缓流出，让样品溶液进入凝胶，至与凝胶层面齐平。柱壁用少量PBS缓冲液小心洗涤2-3次，重复至使缓冲液液面与凝胶层面齐平。(3)洗杂：上样后用8倍柱床体积的BindingBuffer冲洗层析柱，流速1ml/min或用BindingBuffer一直冲洗到流出液中无杂蛋白流出，取20μl流穿液进行SDS-PAGE分析介质的结合效率。(5)洗脱用5-10倍柱床体积的ElutionBuffer洗脱GST融合蛋白，流速1ml/min，收集洗脱峰。取20μl洗脱液进行SDS-PAGE分析其纯度。(6)成功的纯化洗脱液中蛋白纯度应该96％，蛋白浓度应该在2mg/ml以上。4.3注意事项(1)GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为了获得最大的结合量，很重要的一点就是保证足够作用时间，而流速是影响GST融合蛋白与色谱填料结合的关键因素之一，所以必须在上样时维持较低的流速。蛋白的特性、结合pH及温度也是影响结合容量的因素。(2)对不同的GST融合蛋白，洗脱体积和洗脱时间会有所不同，可能会需要更高浓度的还原型谷胱甘肽。如果需要的话，需要对流穿液、洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析。(3)GST融合蛋白的浓度可以通过其在280nm下的吸光度测定，0.5mg/ml的GST融合蛋白A280约为1。(4)GST融合蛋白的浓度也可以通过标准色谱法来确定。如果用Lowry或者BCA分析，样品需要先利用HiTrap脱盐柱进行缓冲液交换处理或者是透析处理。以除去其中的还原型谷胱甘肽，因为还原型谷胱甘肽的存在会干扰测定。此时可用bradford法。(5)GST琼脂糖凝胶能否重复利用要根据样品来定，而且只能用来处理同一种样品，以防止交叉污染。5再生、清洗5.1清洗(1)除去因离子交换作用吸附的蛋白，用2-3倍柱床体积2M的NaCl溶液清洗柱子，然后用5倍柱床体积的PBS缓冲液清洗。(2)除去蛋白沉淀、变性蛋白，用2倍柱体积的6M盐酸胍清洗，然后用5倍柱床体积的PBS缓冲液清洗。(3)除去强的疏水性蛋白和脂质等，用4倍柱床体积的70%的乙醇或者2倍柱体积1%TritonX-100洗柱子，然后用5倍柱床体积的PBS缓冲液洗涤。2.4His标签融合蛋白的纯化（Ni－金属亲和层析法）1．简介其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。基质6%的交联琼脂糖凝胶配基Ni2+吸附载量40mgHis-标签蛋白/ml填料的颗粒大小90μm推荐流速150cm/h化学温度性0.01MHCl0.1MNaOH40℃一周2%SDS1h30%异丙醇30minpH范围3-12保存温度4-30℃保存液体20%乙醇2缓冲液及样品准备2.1缓冲液BindingBuffer：20mMPBS，0.5MNaCl，20-40mM咪唑pH7.4ElutionBuffer：20mMPBS，0.5MNaCl，250-500mM咪唑pH7.4注：1所用试剂及水要高纯度，用前0.45μm滤膜过滤。2结合缓冲液中加入咪唑可以提高his-tagged蛋白的纯度。但是要小心不要在洗涤时把目的蛋白洗脱下来。3结合及洗脱液中咪唑浓度因分离蛋白的不同而不同，要获得高纯度，咪唑浓度应优化。2.2样品处理1）样品上柱前要离心并过滤后才能上样。样品要完全溶解，避免阻塞柱子。2）如果样品不是用结合缓冲液溶解的，就要调整到相应的盐浓度及pH，或用脱盐柱更换缓冲液并且样品中要加入和结合缓冲液中同浓度的咪唑。3批量纯化3.1介质的准备(1)轻轻颠倒盛有Ni-琼脂糖凝胶的容器，量取2ml匀浆到离心管中。(2)500×g离心5min，沉淀介质。(3)小心吸去上清后向介质中加入蒸馏水洗涤。(4)轻轻摇动3min，500×g离心5min沉淀介质。(5)用结合缓冲液重复洗涤一次。(6)将介质转移到量筒中，加入适量结合缓冲液制成50%混悬液，混合均匀。3.2批量纯化(1)每1ml混悬液中加入4ml样品，每1ml50%混悬液可以结合20mghis-标签蛋白。室温轻摇1h。(2)用吸管将混合物转移到一离心管中，(3)500×g离心5min沉淀介质，小心倾去上清，取20μl上清液（流穿液）SDS-PAGE分析介质的结合效率。(4)加入5ml结合缓冲液混匀，洗涤。(5)500×g离心5min沉淀介质，小心倾去上清（洗涤液），取20μl上清液SDS-PAGE分析。(6)重复步骤4、5两次。(7)加入0.5mlElutionBuffer，轻轻混匀，室温孵育5-10min。(8)500×g离心5min沉淀介质，小心收集上清（洗脱液）。(9)重复步骤4、5两次，分别检测三次洗脱上清中目的蛋白的含量，根据结果合并含量较多的上清液。4柱纯化4.1装柱(1)Ni琼脂糖凝胶在20%乙醇中预溶胀，小心倾去乙醇，加入蒸馏水制成50%匀浆。所有试剂耗材的温度应调整到纯化时的温度。(2)连接好柱子，有必要的话柱子上可连接储液槽。(3)用蒸馏水冲洗柱下端，柱底预留10%柱体积的蒸馏水，关闭柱下端出口。(4)用玻璃棒引流连续不断将匀浆注入层析管，静置30min，让加入的凝胶在柱内自然沉降。打开柱下端出口，当液面降到稍高于柱床时，关闭出口。(5)将上液流接头充满结