激光扫描共聚焦显微镜技术

Medicago（苜蓿）crosssectionofastemshowinglignin（木质素）autofluorescenceinblueandchloroplastautofluorescenceinred.ThisimagewastakenwiththeLeicaAOBSconfocalmicroscope激光扫描共聚焦显微镜成像的基本原理激光扫描共聚焦显微镜的基本结构激光扫描共聚焦显微镜的应用量子点技术及其在生命科学研究中的应用•激光扫描共聚焦显微镜技术（LaserscanningConfocalMicroscopy，简称LSCM）是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。•广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、组织胚胎学、免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领域新一代强有力的研究工具。有关共聚焦显微镜的某些技术原理，早在1957年就已提出，20年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜，1985年WijnaendtsVanResandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章，到了1987年，才发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。1水银弧光灯2中密度滤片3光镧4场镧5激发滤片6分光镜（BSP)7物镜8样品9,10发射滤片11目镜BasicsofconventionalfluorescencemicroscopeFluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterConfocalPrincipleObjectiveLaserEmissionPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterDifferencesbetweenconventionalandconfocalmicroscope1122观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。共聚焦显微镜一次只有样品的小部分区域被照明，而普通荧光显微镜则有更宽的区域被照明。共聚焦扫描显微镜的成像原理激光作为光源采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。扫描方式成像激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。光点共聚焦光源和探测器前方都各有一个针孔（照明针孔和探测针孔）。直径约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。ConfocalPrinciple照明针孔探测针孔二色镜或分光镜激光光源激光光源扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）自动显微镜控制系统（数字信号处理器、计算机）图象输出设备（显示器、打印机、存储器）LSCM的基本特点观察方式以荧光为主光源激光（紫外、可见光、近红外）照明方式点照明、逐点扫描成像方式共聚焦、逐点成像输出实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析多重染色样品的观察共聚焦显微镜的主要优点•高分辨率：图像与对比度增强，使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率。•是普通荧光显微镜分辨率的1.4倍（0.51/0.37)普通荧光显微镜分辨率共聚焦显微镜分辨率共聚焦显微镜应用常见错误认识•在实际应用中尽管几乎所有标本都采用的是荧光标记，但决不能将LSCM认为就是一种“高质量图像的荧光显微镜”.共聚焦显微镜并不总是荧光检测的最好工具。•共聚焦显微镜能同时或序贯检测多种荧光通道，但不能将共聚焦显微镜简单地作为一种共存研究的工具。共聚焦显微镜真正的威力是依赖于其强烈抑制焦平面外荧光信号的能力，有很好的深度分辨能力或光学切片功能。基于该性质的应用包括:•样品的显微断层扫描(microscopicCT)•Z扫描切片的3-D重建•厚样品的分辨率多通道同时检测，可实时检测细胞的生理活动和形态变化:•生理学研究：如细胞内各种离子浓度随时间的变化情况.•活细胞多种标记物同时进行成像，动态观察不同形态学事件的发生。如分泌颗粒的分泌过程。•是共聚焦显微镜最基本的功能•可来自单标和多标样本•往往采用固定后的组织或细胞标本；活细胞也可进行特定时间点的单张光学切片1单张光学切片功能vestigialapterousCiD(cyanine5).Notjustthestructureofasinglecell,therelationshipofadjacentcellsatdifferentplanecanalsobeviewedclearlylikebelow:•可用于活细胞或固定细胞的观察、分析2细胞显像CriteriaFixedCellsLivingCellsLimitsofilluminationFadingoffluorophorePhototoxicityandfadingofdyeAntifadereagentPhenylenediamine,etc.NONE!MountantGlycerol(n=1.51)Water(n=1.33)HighestNAlens1.41.2TimeperimageUnlimitedLimitedbyspeedofphenomenon;lightsensitivityofspecimenSignalaveragingYesNoResolutionWaveopticsPhotonstatisticsHertelL.A.,StrickerS.A.andLokerE.S.2000.CalciumdynamicsofhemocytesofthegastropodBiomphalariaglabrata:effectsofdigenetictrematodesandselectedbioactivecompounds.InvertebrateBiology,v.119(#1):27-37.腹足纲一种淡水螺Biomphalariaglabrata血细胞的钙离子动态变化探针：CalciumGreenFuraRedCalciumGreenFuraRed10s肾上皮细胞有丝分裂共聚焦显微镜观察mCherryH2B_mEmEB3骨肉瘤细胞内的内质网mEmerald_ER负鼠肾上皮细胞内体EGFP_Endosomes负鼠肾上皮细胞内溶酶体HeLa细胞的过氧化物酶体Afocusmotorcanmovethestageinpreciseincrementssothatmultipleimagesfromconsecutiveplanescanbeindividuallyscannedandsaved.•（细胞CT)，实现三维重建3光学切片功能步进电机0.1μmBycollectingaseriesofimagesofthespecimenatdifferentdistancesfromthelens(focalplanes)athrough-focusseriesor“Z-series”canbecreated.Lodgepolepine(黑松)NatureCellBiology5,15(2003)Yellowandredfluorescencerepresentsacridineorange-stainedsecondarycellwallsandchloroplasticautofluorescence,respectively.The3Dimagewasreconstructedfromopticalsectionsobtainedonaconfocalmicroscope(FV500,Olympus).Scalebarrepresents20μm.•同时进行荧光多标记（物质共存、空间关系定位等）4.荧光多标记motornerve-Cy2musclebagfiber-Cy3Nucleus-DAPI细胞膜（AlexaFluor488）AlexaFluor594标记的单壁碳纳米管透射光通道重叠图像Hela细胞内化碳纳米管过程12hat37°C•Aconfocalopticalsectiondemonstratesthatduringtelophase,microtubules(red)formaphragmoplast(桶状纺缍体)arrayandperoxisomes(green)aggregateimmediatelyinsidethese.TheDNAinthenucleiisstainedblue.ImagefromCollingsetal.(2003).PeroxisomesMicrotubulesDAPIPeroxisomalaggregationinonionmaybeinvolvedinmembraneproductionand/ormetabolismduringcelldivision•Theroleofhyaluronaninrenalstonedisease透明质酸•Hyaluronanisexpressedbyproliferatingrenaltubularcellsinsubconfluentcultures(2dayspost-seeding).Atcell-cellcontact(4dayspost-seeding)thisstainingstartstofadeawaytocompletelydisappearwhenthetightjunctionsareassembled(5-6dayspost-seeding).ThehyaluronanreceptorCD44isalsoexpressedattheluminalsurfaceinsubconfluentcultures(2dayspost-seeding),atcell-cellcontactCD44istargetedtolateralspaces,whereasatconfluence(6dayspost-seeding),CD44isexclusivelyexpressedatbasaldomainsoftheplasmamembrane.•因为共聚焦显微镜只有焦平面的光线才能成像4厚切片观察Theabovetwoimagesaretakenfromthesamefieldoftheplantof60µmthickbydifferentmeans.ThefirstoneistakenbyCCDcamerainthewildfieldmicroscopeconfiguration.thesecondoneistakenbyconfocalmicroscopywithpinholesizeatoneAiryunit.共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、RNA等细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术