小鼠骨髓细胞提取及培养

小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。2、按照24孔板每个孔2-2.5million的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。4、培养BM细胞的培养基是按照90%GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。