ELISA实验技术

广州医科大学梁雪双夹心法酶联免疫吸附在生物样本分泌型蛋白定性/定量中的应用Page2酶免疫测定技术概述酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相酶免疫测定异相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定•直接法•间接法•夹心法•竞争法1.酶联免疫吸附测定类型概念酶联免疫吸附测定法（ELISA），指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性/定量方法。Page3CoatingantigenAntibodyinsampleenzyme-labeledantibodysubstrateCoatingantigeninsamplesenzyme-labeledantibodysubstrate直接法间接法1用于检测小分子抗原2用于检测抗体Page4CoatingcaptureantibodyAntigeninsamplesubstrateCoatingcaptureantibodyAntigeninsampleenzyme-labeledantigensubstrate夹心法3用于检测大分子抗原竞争法4用于小分子激素、药物enzyme-labeledantibodyPage5将抗体吸附到固相载体上封闭洗涤去掉游离未结合的反应物加入待检样品以及后续试剂孵育加入酶检测底物结果的判读SSESSBiotinylatedantibody2.技术原理EEEsubstrateCoatingcaptureantibodyBiotinylatedenzymemoleculesStreptavidinbridgesPage6生物素-亲和素生物反应放大系统生物素易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。这样，结合了生物素分子的特异性抗体，与结合了酶（如：HRP）的亲和素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物（如：TMB）时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。DH2DHRP2.技术原理TMBHRPSBiotinylatedenzymemoleculesStreptavidinbridges+H2O2+2H2OEPage7操作的标准化反应条件的选择主要试剂及材料3.夹心法测定技术要点技术要点Page8固相抗体eg.Captureantibody--MouseCXCL1/KCMAb(R&Dsystem)标准品eg.Standard--RecombinantMouseCXCL1/KCProtein结合物抗体eg.Detectionantibody--MouseCXCL1/GROalpha/KC/CINC-1BiotinylatedAntibody酶eg.Streptavidin-HRP主要试剂及材料Page9固相载体主要溶液溶液名称保存条件保质期说明1×PBS室温3个月固相抗体包被液1×PBST室温两周洗涤液0.05-0.5%BSA4℃两周封闭液Assaybuffer4℃两周抗体/标本稀释液TMB显色液室温20分钟H2O2:NaAc:TMB=5:4:12NH2SO4室温3个月酶反应终止液固相载体性能的检查：样本10ug/LIgG包被，加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV＜10%返回上一级Page10返回上一级彻底清除非特异性结合的HRP酶反应条件的选择将抗原稀释至合适浓度封闭时间1~2hESESSESSEEPage11加样1加样要加到孔底，但移液枪头不能接触孔底2不可溅出或产生气泡3标准品等比稀释的操作规范洗涤1洗涤次数适当2移液枪头悬空于孔上方3洗涤后孔内洗液尽量弃净比色1双波长法样本OD=OD450nm-OD630nm操作标准化Page12空白对照例如：用PBS代替样品阴性对照检验试剂有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。例如：用标本/抗体稀释液代替样品阳性对照检验试剂有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。加入量应与试剂敏感度相称在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，定量标本待检抗原。4.实验对照的设定阴性对照阳性对照Page135.实例分析候选药物对烟草烟雾提取物诱导的IL-6分泌的影响样本的收集与保存正常对照组16HBE细胞；经CSE刺激的16HBE细胞；经CSE刺激并给予候选药物干预的16HBE细胞。于CSE刺激12h后收集三组样品细胞上清液。包被固相抗体4℃孵育过夜封闭加样及标准品各组细胞上清液；人IL-6标准品冻干粉，按说明书等比稀释成8个孔，绘制标准曲线。加生物素化的检测抗体—HRP—TMB—终止反应Page14结果分析标准曲线拟合度分析y=8.2945x2+68.974x-5.4996R2=0.999905010015020025000.511.522.5ODValueIL-6ConcerntrationODpg/ml2.3282432001.3196731000.729178500.430319250.26841712.50.1623186.250.127423.1250.086741.5625反应了操作的规范性；整套反应系统的可靠性。Page15结果分析各组待测样本的OD处理与分析ODpg/ml2.3282432001.3196731000.729178500.430319250.26841712.50.1623186.250.127423.1250.086741.5625OD450nmOD630nmOD(450-630)CTL0.1653480.0376360.1277120.1611550.0387310.1224240.1598970.0374090.122489CSE0.2400490.0381520.2018980.2517650.0369830.2147820.2268490.0371160.189733CSE+0.1μg/ml0.2002840.0370130.1632710.1943220.0369710.1573510.2046340.0375560.167078说明各组检测值可靠CTLCSECSE+0.1μg/ml0246810***IL-6proteininSupernatant(pg/ml)**P0.01*P0.05Page167.ELISA的应用在临床检验中的应用1体液（血清、血浆、尿液等）中的分泌型蛋白2非肽类激素3抗生素和药物4病原体抗原及抗体在基础研究中的应用1实验动物血清、血浆、组织液（包括关节液、胸腔溢液、尿液）、组织匀浆及细胞培养上清液中的各种蛋白质2非肽类激素3抗生素和药物4病原体抗原及抗体阴性对照待测样品阳性对照Page17THANKS感谢观看延时符