L-丝氨酸的酶法合成及分析

L—丝氨酸的酶法合成及分析目录：L-丝氨酸基本信息理化性质用途丝氨酸的酶法合成实训原理工艺流程图仪器及试剂实训步骤注意事项L—丝氨酸的分析实训原理仪器及试剂实训步骤参考文献L-丝氨酸：基本信息：性状：六面形片状结晶或棱柱形晶体分子式：C3H7NO3。中文名：L-丝氨酸外文名：L-Serine中文别名：L-2-氨基-3-羟基丙酸性状：白色结晶或结晶性粉末,无臭,味甜理化性质：熔点：223~228℃（分解溶解性溶于水（20℃，25g/100ml水）。熔点:222℃相对密度:1.6溶解性:250g/L(20℃)用途：1.作生化试剂和食品添加剂。2.营养增补剂，在化妆品中作为皮肤营养添加剂。3.可供生物化学和营养学研究之用，也可作为合成环丝氨酸的原料。丝氨酸的酶法合成：L-丝氨酸已广泛应用于化妆品、医药、化工等工业领域.目前,国内外L-丝氨酸的生产方法主要为蛋白水解提取水、化学合成法和发酵法.丝氨酸羟甲基转移酶酶法合成L-丝氨酸虽然尚未应用于大规模生产,但由于该法利用甘氨酸和甲醛特异地合成L-丝氨酸,具有原料来源方便、原粒成本低和可合成高浓度产品等优点,因此是最有前景的L-丝氨酸生产方法.在氨基酸的酶法生产中，可以采用游离酶或固定化酶作为物催化剂。与游离酶相比，固定化酶具有以下优点:l.酶不混入产物，易与产物分离;2.酶经固定化后，稳定性提高;3.可长期反复使用，提高酶的使用效率;4根据需要可以制成不同性质、形状的酶;5.可缩小反应体积;6.反应条件比较容易控制等。除将酶固定化以外，还可将含酶的微生物直接固定化，即利用固定化细胞催化反应，一是可降低酶的制备成本，缩短生产周期;二是可完成较复杂的酶反应。实训原理：通过对丝氨酸羟甲基转移酶基因工程菌催化合成L-丝氨酸工艺的研究，确定了最佳工艺条件：工程菌于150v超声破壁20min；工程菌与PLP预温预时间为24h；酶促反应液中辅因子的浓度分别为10mmol/L甘氨酸、0.4mmol/L磷酸吡哆醛、5mmol/L四氢叶酸甲醛浓度应控制在13mmol/L之内；正向酶反应的最适pH为7.5；最适反应温度为37℃。甘氨酸对丝氨酸羟甲基转移酶催化的合成反应无底物抑制作用，且甘氨酸浓度对酶反应速度的影响服从米氏方程的形式。工艺流程图：分析L—丝氨酸的酶法合成仪器及试剂仪器超声波细胞破碎仪，烧杯，玻棒，高速冷冻离心机，离心管，空气浴摇床，锥形瓶，制冰机，移液管，电子天平，纱布等。材料大肠杆菌培养物悬液（含SHMT）培养基LB培养基试剂溶液l:20mmoL/LPLP溶液溶液ll:10mmoL/L甘氨酸(即甘氨酸0.08g)13.3mmoL/L甲醛(即甲醛108uL)0.4mmoL/L磷酸吡哆醛(即磷酸吡哆醛0.01g)5mmoL/L四氢叶酸(即四氢叶酸2mL)0.1mmoL/LPBS(PH8.0)(即磷酸氢二钠94.7mL，磷酸二氢钠5.3mL)终止反应液：100uL实训步骤：1、细胞超声波破碎将150mL大肠杆菌培养物悬液（含SHMT）放入250mL容器中，液体浸没超声波发射针1cm.打开开关，将频率设置至中档，超声波破碎3s,间歇3s,破碎60次。2、离心将破碎好的培养液放入高速冷冻离心机中离心。（10000r/min，10min）离心完毕后取上清液，弃沉淀。注：SHMT是胞内产物，破碎细胞后，即释放到培养液中。3、取已破碎的菌悬液，加入等体积的溶液I(20mmoL/L的PLP溶液)。37℃空气浴摇床震荡温浴30min，然后向锥形瓶中加入溶液II。4、加适量的工程菌悬液，37℃空气浴摇床振荡反应30分钟，调节使PH为7.5。5、加甲醛使浓度达10mmoL/L，PH降至7.22。6、当PH上升至7.42后，加甲醛至7.22，反复加甲醛。直至反应液PH值不随时间变化。7、反应结束后，加入100uL终止反应液，5000r/min离心10min。上清液即为L-丝氨酸反应液。注意事项：1.超声波细胞破碎时，注意冰浴，以免温度过高，导致酶失活。2.加入甲醛时，应在通风橱内进行，避免甲醛对呼吸道的伤害。3.配制溶液II时，各个化学试剂应用分析天平准确称量。L—丝氨酸的分析实训原理：薄层色谱是一种微量、快速和简便的色谱方法。由于各种化合物的极性不同，吸附能力不相同，在展开剂上移动，进行不同程度的解析，根据原点至主斑点中心及展化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因此Rf值较小。在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即Rf值是化合物的物理常数，其大小只与化合物本身的结构有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物。开剂前沿的距离，计算比移值（Rf）。实验器材与试剂（1）实验器材硅胶板，层析缸，毛细管，铅笔，展开剂，显色剂（2）实验试剂展开剂:正丁醇：丙酮：氨水：水（10：10：2：1）100ml指示剂:茚三酮—丙酮（1→50）20ml（3）待测溶液：L-丝氨酸反应液实训步骤：1、试剂准备展开剂以及茚三酮显色剂配制2、划线用铅笔在硅胶板上距末端一厘米出轻轻画一横线。3、点样用毛细管分别吸取待测样品溶液，在横线上轻轻点样，分别点三次。注：点完一次之后等到残余溶剂渗入之后再点样，点样不宜太多，否则会降低Rf值，斑点直径控制在2毫米，不宜超过5毫米。同时点样点之间距离在一厘米左右，防止边缘效应。硅胶板在空气中放置时间要尽量短，否则会因吸潮而降低活性。4、展层将点了样的硅胶板放在盛有展开剂（约0·5cm）的展开槽中。距离硅胶板上端二厘米处取出硅胶板。注：展开剂不能超过一厘米出画的线。由于毛细管作用，展开剂在硅胶板上缓慢前进，样品由于与展开剂的亲和力不同而分离。5、显色展开好后，取出，晾干，用装有茚三酮的喷雾器进行喷雾显色，多数在日光下可找到色点。用铅笔将各斑点框出，并找出斑点中心，用小尺量出各斑点到原点的距离和溶剂前沿到起始线的距离，然后计算出样品的比移值.参考文献：1.L-丝氨酸的生产及其应用克丽凤，张伟国，钱和-《江苏食品与发酵》-20012.运用现代生物技术生产L－丝氨酸的研究进展蔡宇，吴梧桐-《氨基酸和生物资源》-19963.运用现代生技术生产L—丝氨酸的研究进展吴梧桐-《药学进展》-19964.利用重组大肠杆菌生产L-丝氨酸的研究杨帆-《山东大学》-20135.L-丝氨酸高产菌株的选育及基因工程菌的构建谢玉清-《新疆农业大学》-20076.微生物发酵法生产L-丝氨酸及L-半胱氨酸研究进展贾慧慧，李晓静，陈涛，...-《中国生物工程杂志》-20147.L-丝氨酸产生菌的选育及其发酵条件的研究左爱连-江南大学-20088.产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌SYPS-062的代谢工程罗玉常-《江南大学》-20129.L-丝氨酸产生菌的分离筛选及发酵条件初步研究卢发，张伟国-氨基酸、呈味核苷酸生产技术交流会-2004谢谢观看！