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中国组织工程研究第18卷第6期2014–02–05出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchFebruary5,2014Vol.18,No.6P.O.Box10002,Shenyang110180聂德志,男,1966年生,吉林省四平市人,汉族,2006年北京大学毕业,博士,副主任检验师,主要从事干细胞临床前安全性评价研究。通讯作者:宛莹,吉林省拓华生物科技有限公司,吉林省四平市136000doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.011[]中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2014)06-00888-06稿件接受:2013-12-27NieDe-zhi,M.D.,Associatechiefanalyst,JiLinTuoHuaBiologicalTechnologyCompany,Siping136000,JilinProvince,ChinaCorrespondingauthor:WanYing,JiLinTuoHuaBiologicalTechnologyCompany,Siping136000,JilinProvince,ChinaAccepted:2013-12-27Balb/c裸鼠体内的干细胞致瘤实验聂德志,宛莹,贲亮,王英君,刘湘竹,王丽辉,李超,张世冬(吉林省拓华生物科技有限公司,吉林省四平市136000)文章亮点:实验的创新点在于以间充质干细胞和神经干细胞作为研究对象,将其移植在Balb/c免疫缺陷裸鼠皮下进行致瘤性实验;以2010版《中国药典》三部为依据,增加了干细胞的移植数量,观察对致瘤性的影响;将体内致瘤实验和体外软琼脂克隆形成实验相结合来评价干细胞移植前后的安全性。关键词:干细胞;神经干细胞;间充质干细胞;致瘤性;克隆;体内实验;安全性主题词:干细胞;神经干细胞;间质干细胞;致癌性试验;视网膜色素上皮摘要背景:干细胞致瘤性研究是临床应用干细胞安全性所面临的实际问题。因此明确干细胞是否具有致瘤性尤为重要。裸鼠在肿瘤学、免疫学、药品及生物制品的安全性评价领域占据愈来愈重要的地位。目的:将神经干细胞、间充质干细胞移植在Balb/c免疫缺陷裸鼠皮下,检测其是否具有致瘤性。方法:将免疫缺陷Balb/c裸鼠随机分为5组,除空白组外,阳性对照组、阴性对照组、神经干细胞组和间充质干细胞组分别将肝癌细胞HepG2、人视网膜色素上皮细胞、传代至第4代的神经干细胞和间充质干细胞接种于裸鼠皮下,于注射后12周进行解剖检查,观察裸鼠移植部位肿瘤形成情况。同时进行软琼脂克隆形成实验,考察神经干细胞和间充质干细胞在体外软琼脂克隆形成情况。结果与结论:裸鼠致瘤性实验结果显示,空白组、阴性对照组、神经干细胞组、间充质干细胞组在接种12周后,未在裸鼠注射部位形成肿瘤,病理组织学检查未见异常。软琼脂克隆形成实验结果显示,神经干细胞和间充质干细胞在软琼脂阻力介质中未表现出细胞形成克隆的能力。提示短期传代后的神经干细胞、间充质干细胞不具有致瘤性。聂德志,宛莹,贲亮,王英君,刘湘竹,王丽辉,李超,张世冬.Balb/c裸鼠体内的干细胞致瘤实验[J].中国组织工程研究,2014,18(6):888-893.StemcelltumorigenicityinBalb/cnudemiceNieDe-zhi,WanYing,BenLiang,WangYing-jun,LiuXiang-zhu,WangLi-hui,LiChao,ZhangShi-dong(JiLinTuoHuaBiologicalTechnologyCompany,Siping136000,JilinProvince,China)AbstractBACKGROUND:Stemcelltumorigenicityisapracticalissueconcerningstabilityintheclinicalapplicationofstemcells.Therefore,itisparticularlyimportanttoclearwhetherstemcellshavetumorigenicabilityornot.Nudemiceoccupyanincreasinglyimportantpositioninoncology,immunology,andsafetyevaluationofdrugsandbiologicalproducts.OBJECTIVE:ToobservethetumorigenicityofneuralstemcellsandmesenchymalstemcellsinBalb/cnudeimmunodeficientmice.METHODS:Balb/cnudemicewererandomlydividedintocontrolgroup,negativegroup,positivegroup,neuralstemcellgroupandmesenchymalstemcellgroup.HepG-2cells,RPEcells,passage4neuralstemcellsandmesenchymalstemcellswereinjectedsubcutaneouslyintonudemicefromdifferentgroups,respectively.After12weeksofinjection,anatomicalobservationwasperformedtodetectthetumorformationinthetransplantationsite.Meanwhile,softagarcolonyformationassaywasappliedtoinvestigateneuralstemcellandmesenchymalstemcellcloneinvitro.RESULTSANDCONCLUSION:After12weeksofinjection,thetumorigenicitystudyresultsshowedthatnotumordevelopedinthetransplantationsiteinthecontrolgroup,negativegroup,neuralstemcellgroupandmesenchymalstemcellgroup.Histopathologicexaminationsalsoshowednoabnormalityinthesegroups.Softagarcolonyformationassayshowedinsoftagarresistancemedium,neuralstemcellsandmesenchymalstemcellsdidnotexhibitcloneability.Thesefindingsindicatethatneuralstemcellsandmesenchymalstemcellsundergoingshort-termpassageshavenotumorigenicgrowth.Subjectheadings:stemcells;neuralstemcells;mesenchymalstemcells;carcinogenicitytests;retinalpigmentepithelium聂德志,等.Balb/c裸鼠体内的干细胞致瘤实验ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH889(6):888-893.0引言Introduction干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体,它能长期地自我更新,在特定的条件下具有分化形成多种终末细胞的能力。近年来对干细胞的研究与应用几乎涉及到所有生命科学和生物医学领域。因此,探讨干细胞临床前应用的安全性是有效开展干细胞治疗的前提。目前临床研究上应用的干细胞以造血干细胞居多,对其特性、功能的研究及安全性评价的研究国内外已有较多报道。间充质干细胞是除造血干细胞外开展临床研究最多的干细胞类型,在体内或体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能[1-10]。神经干细胞是未分化的原始细胞,不表达成熟的细胞抗原,不被免疫系统识别,具有低免疫原性,主要来源于胎儿脑组织,由于受伦理限制,获得困难,研究证明通过自身骨髓或脐带血间充质干细胞诱导分化获得神经干细胞,因此是各种神经损伤的治疗的新的靶点细胞。在治疗脑瘫、脑梗死、脑出血的等脑病上发挥较好的改善作用[11-18]。本实验将间充质干细胞和神经干细胞作为观察对象,来进一步评价其临床前安全性。细胞的致瘤性检测一般采用动物体内接种法,可以根据细胞的特性及动物的敏感性选择动物的种类,国内及WHO建议可以采用裸鼠或经抗胸腺抗体处理过的新生小鼠,以一定的细胞量进行体内接种[19-20],检测细胞的致瘤性。实验将神经干细胞和间充质干细胞进行体内裸鼠的致瘤性实验研究,旨在说明神经干细胞和间充质干细胞的移植对裸鼠致瘤性的影响,从而为干细胞安全性考察奠定实验基础。1材料和方法Materialsandmethods设计:细胞学体外观察实验。时间及地点:于2012年7月至2013年4月在中国医科大学四平医院吉林省组织工程研究重点实验室完成。材料:实验动物:雄性裸鼠,体质量17-19g,无特定病原体(SPF)级胸腺缺陷Balb/c型,来源于上海斯莱克实验动物有限公司,动物质量合格证号:SXCK沪2012-0002。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethicalissuesinanimalexperimentation》相关动物伦理学标准的条例。饲料为吉林大学实验动物中心生产的60Co辐照灭菌大小鼠全价颗粒饲料。垫料为吉林大学实验动物中心生产的60Co辐照灭菌杨木刨花垫料。实验方法:实验分组:动物饲养于万级屏障环境的独立通气笼盒(IVC)笼内,由获得资格认可的动物管理人员饲养。室温19-25℃,湿度40%-70%,12h照明,12h黑暗;标准饲养盒内喂养,每盒2-4只。按照《中国药典》三部(2010版)要求进行[21],将裸鼠按随机数字表法分为空白组、阳性对照组、阴性对照组、间充质干细胞组、神经干细胞组,每组15只。细胞处理方式为前肢右腋下皮下注射。空白组注射同批次细胞培养基,肝癌细胞(HepG2)阳性对照组每只裸鼠注射2×107个细胞;人视网膜色素上皮细胞阴性对照组每只裸鼠注射2×108个细胞;神经干细胞组每只裸鼠注射2×107个细胞;间充质干细胞组每只裸鼠注射2×108个细胞;给药体积为0.2mL/只;给药次数为单次给药。分别于注射后21d和12周对实验动物麻醉颈椎脱臼处死后,对注射部位进行大体解剖观察和病理组织学检查,观察肿瘤形成情况,每次雌雄各解剖7只动物。实验所用脐带源间充质干细胞P3细胞分别进行了成骨、成脂诱导,诱导21d后,分别使用茜素红染色检测钙盐的形成和油红O染色法检测脂滴。流式细胞仪结果表达CD75,CD90,CD105,不表达CD14,CD19,CD34,CD45和HLA-DR。神经干细胞免疫组化检测表达Nestin和Musashi,并可分化为神经元、星形胶质细胞,证实该细胞球具有增殖及分化的干细胞特性。软琼脂克隆实验:按常规方法洗涤细胞、计数[22],制成细胞悬液即空白组、阳性对照组、阴性对照组、神经干细胞组、间充质干细胞组。将1.2%低熔点琼脂糖与2×培养基以
本文标题:Balbc裸鼠体内的干细胞致瘤实验
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