生物反应器-zhangrui

基因工程概论——家蚕生物反应器ZhangRui082300009江苏科技大学生物与环境工程学院08级研究生•WhatIsBioreactor?•Abioreactorisavesselinwhichiscarriedoutachemicalprocesswhichinvolvesorganismsorbiochemicallyactivesubstancesderivedfromsuchorganisms.家蚕生物反应器主要内容概念设计基础成就发展及前景生物反应器听起来有些陌生，基本原理却相当简单。1.胃就是人体内部加工食物的一个复杂生物反应器。食物在胃里经过各种酶的消化，变成我们能吸收的营养成分。2.生物工程上的生物反应器是在体外模拟生物体的功能，设计出来用于生产或检测各种化学品的反应装置。或者说，生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或固定化细胞反应器等。一基本概念•3.家蚕生物反应器是指把人类基因放入家蚕体内培养，使家蚕能生产出人类蛋白质，然后把蛋白质萃取出来，制成口服药，用于治疗肿瘤病人和艾滋病人放化疗后产生的白细胞减少症和提高免疫力。二设计基础•转基因动物生物反应器生产药用蛋白一般有两种技术路线。•第一种是将目的基因在同源组织中表达蛋白质；•第二种是将目的基因构建成杂合基因，转入动物胚胎，通过转基因动物的分泌器官收集并提纯药用蛋白。转基因动物分泌的蛋白经过后加工酷如人体天然蛋白的结构，也有完全相似的生物活性。•桑蚕生物反应器主要有两种形式;1.转基因桑蚕(transgenicsilkworm)2.杆状病毒表达载体系统(BaculovirusExpressionVectorSystem,BEVS)。;1.家蚕核型多角体病毒(BmNPV)IE-1基因启动子及其控制下的hGM_CSF基因克隆到PigA3GFP中,构建了家蚕转基因载体PigA3GFP[IE-GMCSF],2.利用压力渗透法和精子介导法将此载体与其辅助质粒helper-pigA3导入家蚕,获得了发绿色荧光的家蚕。3.提取家蚕基因组DNA用PCR法可检测hGM-CSF基因,推测hGM—CSF基因已整合进家蚕的染色体,对G3代转基因家蚕用ELISA进行hGM-CSF的活性测定,结果表明转基因家蚕冻干粉中hGM-CSF的量为95ng/100mg。另外,我们将SARS病毒的M蛋白完整基因克隆进原核表达载体pET28a(+),在大肠杆菌BL21中诱导表达,分析表明大肠杆菌中表达的重组M蛋白的分子量为28KD,与理论值相符,此外还有一条分子量为18kDa左右的条带,推测与大肠杆菌密码子的偏爱性或表达产物的降解有关（一）以蚕为生物反应器的开发利用20世纪90年代以来，以家蚕核型多角体病毒为载体表达外源基因的研究蓬勃开展，方兴未艾。据统计，国内外有200多家单位开展该项工作，表达基因数超过400余种。最为引人瞩目的是可以利用家蚕生物反应器生产人干扰素、流行性感冒病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗等人用药物，以及猪生长素、鱼类生长素等畜用物质。（二）一头蚕就是一个微型工厂蚕体是生产重组蛋白的最优良生物反应器蚕吐丝结茧的机能被人类利用已有几千年的历史，蚕丝是天然纤维，但它本质上是蛋白质，经过长期的育种，蚕尤其是家蚕已成为世上最好的蛋白质生产者。随着生物技术在蚕业研究上的应用和昆虫生理研究的深入，形成了以家蚕为生物反应器表达外源基因，生产高附加值活性蛋白（多肽）的新研究领域。家蚕杆状病毒（Bm.NPV）载体表达系统的问世是这一研究领域兴起的标志。前田进（1984）建立了世界上第一个Bm.NPV载体表达系统，并成功地用家蚕生产出人的а-干扰素。•（三）家蚕杆状病毒表达系统具有的独特性：（1）Bm.NPV基因组是环状双链DNA，容易用切割与连接等生物技术进行修饰；一个杆状的衣壳，允许病毒含有额外的DNA片断，即使插入7-8Kb的DNA也能形成正常的病毒（2）多角体蛋白基因是在感染末期有选择地进行表达的基因，它与病毒粒子的形成没有关系，故将这个基因调换成或插入其他基因也能形成感染性病毒粒子；多角体蛋白有非常强有力的启动子，在感染末期，多角体蛋白已达到全部蛋白质的20-30%；多角体能够用光学显微镜观察，如果将此作为插入基因的标记物，就能够很容易地判断出重组病毒并将其克隆。（3）缺乏多角体的Bm.NPV在生命体外极易失活，即具有较好的环境安全性。（4）家蚕是BmNPV的天然宿主，其生物学背景清楚，而且能大量饲养，饲养成本低，无需建造发酵罐那样的巨大投资。（5）蚕体血淋巴内有蛋白分解酶的的抑制物，对分泌蛋白的产量明显高于其他系统（1000倍以上）；（6）对蛋白质的翻译后加工方式与高等生物的加工方式很相似，其表达产物与天然状态下的空间结构极为相似；（7）由于感染晚期宿主细胞蛋白合成量减少，所以重组外源蛋白的分离纯化方便。几千年来家蚕群体培养技术不断完善，现在可以在计算机控制下大量饲养家蚕，使用这种昆虫系统为外源基因产物的大量生产提供了令人鼓舞的前景。三取得成就用这些表达系统表达的外源基因已达数百种。其中比较重要的有：人а-干扰素(IFN-d)，人与小鼠介素3、介素4(IL-3,IL-4)，人免疫缺陷病毒(HIV-I即艾滋病毒)的核心蛋白(gsg)，人乙型肝炎病毒表面抗原(HBV52-sAg),人丙型肝炎抗原，人血小板因子Ⅳ（HPF4）；昆虫行动激素酯酶(JHF)等（一）6×His-猪生长激素的获得•将通过PCR技术改建并去除了信号肽的猪生长激素cDNA基因克隆入转移栽体pBacPAK-His1，构建了重组转移载体pPGH030．进而将pPGH030与线性化病毒Bm-BacPAK6共转染BmN细胞．成功获得了猪生长激素重组杆状病毒Bm-BacPAK6-pgh。感染重组病毒的细胞可溶性蛋白SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示，感染细胞蛋白电泳带的25kD处有1条猪生长激素特异带。Bm-BacPAK6-pgh的BmN细胞培养液接种家蚕5龄幼虫和蛹，感病幼虫与蛹血淋巴的SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明，6×His-猪生长激素融合基因在家蚕体内得到了表达，特异性条带大小约为25kD。（二）家蚕生物反应器生产肿瘤坏死因子家蚕也是一种重要的生物反应器。构建一种新的杆状病毒BactoBac系统Bonpvid。通过转座栽体将人的肿瘤坏死因子(TNF)基因转座到Banpvid的杆状病毒基因组上，并令其处于多角体基因的强启动子控制之下而得到重组病毒rABtnf，以其感染两种昆虫细胞sf9和BmN均检测到TNF蛋白的高水平表达。（三）利用家蚕生物反应器生产广适性、高比活植酸酶和酸性碳酸脂酶利用重组杆状病毒在昆虫体内表达、生产植酸酶的方法，包括：将植酸酶基因与杆状病毒载体进行重组；用重组病毒载体感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行植酸酶表达；收集含植酸酶的家蚕幼虫或蛹的体液。通过这种方法可以大量、廉价地生产植酸酶，用做饲料添加剂。添加家蚕生物反应器生产的植酸酶饲养的鸡，日增重量比对照提高7.41%，饲料转化率提高5.93%，鸡粪便中磷的排泄量下降37.74-42.49%。（四）生产口服升白细胞药物——瑞福康胶囊•瑞福康胶囊以优质蚕蛹和蚕卵为主要原料，经生物高科技和环境诱导产生的大量活性蛋白质，利用生物工程技术精制加工而成的以生物活性蛋白为主要成份的药品。•功能◆增加白细胞◆瑞福康在临床上主要用于治疗肿瘤病和艾滋病人放化疗产生的白细胞减少，对骨髓衰竭、白血病、骨髓移植等均有治疗或辅助治疗的效果•◆提高人体免疫能力特性1.吞噬体内有害物质2.抗病毒3.提高免疫力的效果，作用直接。这是中国也是国际上第一个利用家蚕生物反应器生产基因工程口服蛋白质药物进入临床试验阶段。解决了蛋白质药物口服这一世界性技术难题。（五）人乙型肝炎病毒表面抗原(HBV52-sAg),•应用PCR突变的方法,在乙肝病毒表面抗原(HBsAg)前S2序列的5’端融合了BmNPV多角体蛋白基因5’端的12个碱基,获得了融合乙肝表面抗原中蛋白基因(HBMp);通过同源重组将其插入到BmNPV基因组多角体启动子后,构建了重组杆状病毒BmPAKHBMp。用重组病毒BmPAKHBMp和BmPAKHBM(带有非融合乙肝表面抗原中蛋白基因)感染家蚕细胞及蛹,对两种病毒的表达产物用ELISA进行了跟踪检测,结果表明融合蛋白比非融合蛋白HBsAg活性提高了60%～80%,作为HBsAg构成部分的PreS2抗原性提高了8～10倍;并且HBsAg和PreS2Ag表达的时相曲线不同,PreS2Ag的表达量比HBsAg早1～2d达到最大值。ELISA检测和Westernblotting分析表明,多角体基因序列的存在更有利于中蛋白全基因(PreS2+S)的表达。（六）人血小板因子Ⅳ（HPF4）•将人血小板因子Ⅳ(HumanPlateletFactorⅣ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,获得重组转移载体pBacPAKPF4,并与线性化病毒BmBacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞,在细胞内发生同源重组,获得重组病毒BacPAKPF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞(2×106个细胞)和家蚕5龄幼虫,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性,测得表达量在家蚕培养细胞中第3天达到最高值为6088μg/2×106个细胞;在蚕体内表达第5天达到最高值,表达量明显高于家蚕培养细胞（七）生产有机磷农药消解酶•利用重组杆状病毒在家蚕体内表达、生产有机磷农药消解酶OPDA的方法，包括：有机磷农药消解酶基因与杆状病毒载体进行重组；用重组病毒载体感染宿主家蚕；被感染的家蚕宿主进行有机磷农药消解酶的表达；收集含有机磷农药消解酶的家蚕幼虫或蛹的体液或匀浆进行加工制备酶制剂。通过这种方法可以大量、廉价地生产有机磷农药消解酶，用于水果、蔬菜及其他农产品的残留农药的酶法降解、无农药污染农产品的生产，也可用于土壤、水域等环境中的残留农药分解净化。（八）生产病毒疫苗•将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2／4／3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后，将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达．用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡，安全性试验表明，接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化；在免疫一攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDVVP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组，并于28日龄加强免疫，25d后用IBDV强毒BC6／85攻击．通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明，基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答，比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力，更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分．用Bm.NPV载体系统生产的人艾滋病毒膜蛋白诊断人艾滋病，正确率达到100%，美国政府已批准用于艾滋病人体免疫预防注射试验；浙江大学生化研究所用家蚕表达的基因工程丙肝抗原用于丙肝疫苗研制，已有很大进展。。（九）诊断人艾滋病问题与展望•在转基因动物生物反应器的应用中，有些问题尚待解决。•1.由于转基因动物的基因是镶嵌整合型的，因此它的下一代并不都转基因型。•2.外源基因的整合率低，胚胎移植的受孕率低等都使有效的转基因动物大大减少。•3.对调控表达水平的程序，指导进行精确的组织特异性和发育调控表达的程序，以及调控和编码内含子序列间可能的相互作用的认识尚不充分容易引起异位点表达；•4.现在的技术还不能控制整合的位点，因此存在对内源基因进行插入诱变的可能性，转基因型的表达会受整合的不同位点的影响。•5.转基因动物生产的药用蛋白可用于预防和治疗疾病，其转运系统及口服用药引起的耐受性等问题都在作进