转基因植物及其产品检测-质量控制与标准物质应用

转基因植物及其产品检测质量保证与标准物质应用金芜军中国农业科学院生物技术研究所2010-05-06，杭州主要内容一、PCR检测质量保证二、核酸检测标准物质三、标准物质在转基因检测中的应用四、国内外转基因植物及其产品检测标准物质五、标准物质的使用六、标准物质管理PCR检测质量保证基本概念：•质量保证（qualityassureance，QA）•（实验）室内（部）质量控制（internalqualitycontrol，IQC）•（实验）室间质量评价（externalqualityassessment，EQA）•准确度（accuracy）•偏差（bias）•精密度（precision）•重复性条件（repeatabilityconditions）•批（run）•均值（mean）•标准差（standarddeviation，SD或s）•变异系数（coefficientofvariation，CV）•正态分布（gaussiandistribution）室内质量控制与室间质量控制室内质量控制（IQC）：–人员–批内及批间重复性–结果可靠性和有效性；即时评价室间质量控制（EQA）：–第三方机构：农业部科技发展中心；农业部系统其他质检机构；质检系统；JRC；GIPSA–准确度；不同实验室结果可比性–操作与方法；回顾性评价精密度与准确度●●●●●即准确又精确●●●●●准确而不精确●●●●●即不准确又不精确●●●●●精确而不准确均值、标准差与变异系数)1()()(1212nnnSDniniiiXX标准差nniiX1X）均值（%100XSDCV测定值的分布质量保证：IQC与EQA确定检测目的、内容采样准备采样分样样品运输、保存送样样品接收、编号样品检测检测结果的有效性仪器设备的有效性试剂的质检结果分析判读报告管理决策采样检测报告IQCEQAQA检测前质量控制实验室环境与仪器设备管理实验室环境PCR后PCR（电泳分析）PCR反应体系配制I溶液配制样品接收样品前处理DNA提取纯化PCR反应体系配制II样品保存DNA样品保存仪器设备及材料管理•仪器设备维护及校准天平、移液器、定量PCR仪•离心管质检：防污染；定量PCR•吸头，tips：防污染•日常核查：灰尘、细菌，其他实验材料；前次反应产物日常核查要点工作项目核查要点水浴、干浴设备□温度校准及记录生物安全柜□先启动运行30min后再开始工作IQC弱阳性质控□有低中高浓度质控（定量）□有阴性质控：原样品□有经历提取过程空管□有仅含扩增反应混合液管□有实验台面□消毒、清洁□紫外照射加样器、离心机□消毒、清洁实验室各区□单向流动□紫外照射试剂质量核酸提取试剂：尽量简化步骤，降低试剂污染概率PCR扩增试剂—引物、探针：纯度，“错误序列”；特异性—缓冲液、dNTP：KCl/NaCl；Mg2+；dNTP平衡且在20-200μmol/L—Taq酶：比活性20U/pmol试剂贮存：PCR，-20℃；提取试剂，2-8℃试剂质检–内外包装–性能–抗干扰操作程序•检测过程涉及多个环节：采样、样品保存、制备、试剂配制、核酸提取、PCR扩增、产物检测、结果分析、报告•每一环节都会产生变异•过程引起的变异，每一步骤变异总和：...)(222SDSDSDcbaSD主要污染源样品本身实验室其他实验材料上次检测残留物环境主要防污染措施严格分区、单向流动化学清洁：10%次氯酸钠；70%乙醇扩增产物修饰：不能干扰正常扩增检测•扩增前修饰：紫外照射，环丁嘧啶二聚体、嘧啶6，4-二聚体等；尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG），前次扩增用dUTP代替dTTP，后次反应前UNG处理反应管•扩增后修饰：使扩增产物不能作为下次扩增的模板质控数据评价阳性质控样品失控（假阴性）原因：–随机误差–仪器–试剂预防措施：–核酸纯化–重复与平行的设置–样品稀释–使用内质控（internalcontrol，IC）假阴性原因分析流程阳性质控样品测定结果偏低或为阴性结果偏低阴性测试样品中无强阳性测试样品中有强阳性离心管含抑制物Taq酶活性低核酸提取效率低核酸提取失败核酸提取抑制物残留核酸提取试剂混入PCR仪孔间温度差异Taq酶失活系统误差随机误差测试样品中有阳性测试样品全为阴性更换离心管更换Taq酶更换提取试剂所有样品重新检测已知DNA同孔扩增更换试剂结果正常结果仍低质控样品及3-5份已知阳性质控样品正常且阳性样品有些值增加质控及已知阳性样品仍异常PCR仪孔温度校准后再检测按系统误差途径分析验证措施阴性质控样品失控原因与预防•原因：污染•措施：防污染工作项目核查要点实验台面□消毒、清洁□紫外照射加样器、离心机□消毒、清洁实验室各区□单向流动□紫外照射假阳性结果分析流程阴性质控样品测定为阳性同时检测样品的情况测试样品亦全为阳性测试样品中有阳性也有阴性扩增产物污染试剂污染3-5空管室内静止5-8份水样品检测暂停日常检测，实验室清洁、通风试剂直接扩增检测更换试剂扩增产物轻度污染样品间交叉污染5-8份水样品检测有阳性则确认有实验室污染无阳性说明样品间交叉污染改善操作验证验证措施措施室间质量评价EQA方案，样品设计与准备：5-8份组合报告格式：统一报告内容：清楚、简洁方法：统一方法；与日常检测方法一致总结：方法、试剂、仪器评价：特异性、灵敏度、符合率EQA报告：及时核酸检测标准物质•应用历史•主要应用范围•转基因植物及其产品检测标准物质概况：–IRMM–AOCS–农业部–出入境系统标准物质•具有一种或多种足够均匀和很好地确定了特性，用以校准测量装置、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质•用最接近真值的接受参照值，作为统一量值的计量标准•可保存、传递信息和量值•本身是一种物质或材料；而不是一种器具或装置•是计量标准的一种形式，要通过检定并正式批准，具有确定的检定数据和证书，具有一定的法律地位•必须在规定条件下具有高稳定的物理、化学或计量学特性•标准物质的保证值：UA与标准物质相关的一些概念•标准物质（referencematerial，RM）•有证标准物质（certifiedreferencematerial，CRM）•测量标准（measurementstandard）–一级测量标准或一级标准（primarymeasurementstandard或primarystandard）–二级测量标准或二级标准（secondarymeasurementstandard或secondarystandard）–工作测量标准或工作标准（workingmeasurementstandard或workingstandard）•国际标准（internationalstandard）•国际约定校准物质（internationalconventionalcalibrationmaterial）•溯源性或计量学溯源性（traceability或metrologicaltraceability）•测量程序（measurementprocedure）•测量方法（methodofmeasurement）•国际约定参考测量程序（internationalconventionalreferenceprocedure）•国际测量标准或国际标准（internationalmeasurementstandard或internationalstandard）•测量不确定度（uncertaintyofmeasurement）•国际单位（internationalunits，IU）•决定性方法（definitivemethod）•参考方法（referencemethod）•质控品（controls）•稳定性（stability）•均匀性（homogeneity）•基质效应（matrixeffect）≠互通性（commutability）•国际单位制(InternationalSystemofUnits,SI)核酸检测用标准物质的溯源关系•转基因检测中的“核酸”不能直接用物理或化学方法测定，所以没有传统意义的一级参考测量程序和一级标准物质•核酸检测可以有：国际标准物质、国家或地区标准物质、实验室内部的工作制剂•病毒检测：临床检验标准物质——英国国家生物学标准物质和质控物研究所，NIBSC•转基因检测国际标准物质？量值溯源•溯源到国际基准（SI）：做不到•溯源到方法：标准方法；先有标准方法还是先有标准物质•溯源到人工标准：合成核酸？核酸检测一级参考测量程序的替代方法为了在不同实验室间的统一测量程序，可以为核酸检测建立所谓“参考测量系统”，包括三方面内容：参考方法参考物质参考实验室核酸检测标准物质种类基质质粒基因组DNA合成核酸序列标准物质在转基因检测中的应用检验校准标准或测量工作标准方法评价：符合度、不确定度检测校正：统计学意义的质量控制；检测结果的回溯；质量评价和质量控制能力测试质控结果：不可能进行重复测定仲裁：不同实验室检测结果不一致PCR检测标准化试剂方法的标准化工作程序的标准化标准物质（校准品）具有可比性的可靠结果传统理化检测与转基因检测中标准物质的使用采样，处理保存样品制备检测鉴定或定量检测求值评价采样，处理冷却，保存；4℃或-20℃DNA提取纯化定性PCR或定量PCR检测结果与标准物质或其他参照物比较结果判定定性参考物质定量参考物质标准物质核酸检测中的量值传递（质粒或合成DNA标准物质）•以一种材料的特性值来校准另一材料统一特性的值•取决于适合的标准物质及其在检测程序中的可代替性–标准物质的特征值与被测量一致–具有足够大特性值，可以稀释成方法工作范围的不同浓度–对特定检测目的的可代替性/适合性已得到证明–稳定性和均匀性经过验证方法评价要点：•特异性•灵敏度•符合度注意事项：•统计学方法•全面：方法、试剂、实验室水平•严重误差产生的原因•其他方面：检测的干扰因素偏离的估算偏离的估算是方法评价的重要指标，标准物质可为方法偏离估算提供必要信息：–认定值，不确定值在限制范围内–经认定的由方法引起的不确定值对标准物质的要求–标准物质类别（基质）在方法测定范围内–标准物质浓度在方法工作范围内–不同浓度标准物质，最好能涵盖方法的所有测量范围标准物质作为工作标准•最广泛的用途，工作曲线•不同实验室使用相同标准物质，保证结果可比性方法研究中的标准曲线：•自制内部参考物质制作标准曲线•选择几个点，标准物质作外部参考物质评价检测结果的可靠性•平均值的置信区间（U）公式：•用标准物质的U来判断结果的可靠性–标准物质与样品平行测定–如果标准物质的分析结果与标准物质证书上的A±U一致，表示样品检测结果可靠公式：ntSXU/UntSAX22)/(检验仪器的可靠性（精密度、准确度）•确定仪器处于正常运转状态•用测定实际样品的操作方法和程序测定标准物质•测定结果与标准物质保证值一致，表明仪器正常运转•尽量使用纯标准物质：质粒标准分子、基因组DNA、合成DNA序列UntSAX22)/(国内外转基因植物及其产品检测标准物质•IRMM•AOCS•出入境检验检疫局•重大专项标准物质的使用：选用原则1、对特定检测目的的适用性，包括对基质效应、量值间隔、不确定度的要求：•被测量值•测量区间（浓度）•基质匹配性及可能的干扰因素•样品量大小•均匀性和稳定性•测量不确定度2、证书的有效性及不确定度的值3、标准物质及其生产者的以往记录，包括：是否进行实验室间比对（定值）是否使用不同检测方法进行了检验是否有其他实验室应用的成功经验4、标准物质证书及研制报告内容5、标准物质的研制与定值程序是否符合相关标准根据用途选择标准物质方法建立与评价方法建立的步骤：–方法研究–方法实施–方法验证–方法性能监测使用标准物质确定方法的不确定度、特异性和灵敏度方法校正（定量方法）•一般仅纯物质标准物质可用于测量阶段的校准•质粒分子或基因组DNA可用于校正•标准物质作为内部控制，用于确定检测过程中样品的损耗、污染、干扰及其对应的不确定值•当待测样品与标准物质特性