1基因工程药物

基因工程药物基本知识介绍现代生物制药技术田芳基因工程药物概论基因工程药物含义基因工程药物是指采用基因工程技术研制的，能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以用传统方法制取的特殊药物。一、基因工程药物种类蛋白细胞因子药物蛋白类激素溶血栓药物治疗用酶可溶性受体和黏附分子其它核酸DNA药物反义RNA药物RNAi药物核酶重组蛋白质类药物细胞因子药物：干扰素、集落因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子、凝血因子蛋白质类激素药物：生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、促卵泡素、甲状旁腺素、降钙素、胰高血糖素、促黄体生成素、甲状腺刺激素和心钠素等。溶血栓药物：组织型纤溶酶激活剂、尿激酶型纤溶原激活物、蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂、链激酶和葡激酶等。治疗用酶：超氧化物歧化酶、羧肽酶、尿酸氧化酶、葡糖脑苷脂酶、脱氧核糖核酸酶和胸苷激酶等。可溶性受体和黏附分子：可溶性补体受体Ⅰ型其他：血红蛋白、白蛋白等。核酸类药物核酸类药物主要是在核酸水平(DNA和RNA)上发挥作用，它通过纠正突变的基因并使之重新获得适当的功能来治疗或预防疾病。特点是：能将基因表达的产物的作用局限于病变组织周围，从而使治疗更具针对性；只要转化细胞不被清除，转化的式因不被抑制，基因表达的产物就可以持续发挥作用。基因工程药物的特点从根本上解决了某些药物的生物原料适应证不断延伸技术含量高加速疑难病症新药物的开发二、研制基因工程药物的关键技术确定研制基因工程药物的技术路线基本技术路线1：获得具有预防和治疗作用的蛋白质的基因组入表达载体受体细胞高效表达动物试验临床试验申报新药证书基本技术路线2：基因组未知功能的人类基因全长cDNA群组入表达载体受体细胞瞬间表达功能初筛功能验证重组蛋白表达体内外药效分析临床前研究临床验证申报新药证书优点：目的明确。缺点：发现新药的机率低，在人体内表达量较高的蛋白质才有较大可能被开发。建立在庞大人类基因资源基础上的，具有巨大的开发潜力，缩短新药开发的时间，可大规模增加新药的数量。建立基因高效表达系统微生物表达系统1动物细胞表达系统2动物活体表达系统3植物表达系统41构建流程2表达载体构建3工程菌构建基因工程大肠杆菌的构建技术表达载体设计目标基因的定位克隆酶切反应连接反应转化筛选与鉴定表达载体构建动物表达系统优点：一是哺乳动物细胞能够表达人或哺乳动物的蛋白质；二是哺乳动物细胞可对表达的蛋白质进行正确折叠、组装和糖基化等加工,生产有生物活性的产品。缺点：用转基因动物细胞生产药物成本昂贵。转基因动物是指通过实验方法，人工的把外源基因导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使外源基因与动物本身的基因组整合在一起，因而外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。动物活体表达系统-转基因动物1982年，R.D.Palmiter等科学家将金属硫蛋白基因的启动子和大白鼠生长激素基因拼接成融合基因，把这种基因导入小白鼠的受精卵，再将这一受精卵移植到一借腹怀孕的母鼠体内，生下来的小鼠比正常小鼠体格大一倍，称为“巨鼠”。动物活体表达系统-乳腺生物反应器基本方法是：将药用蛋白质基因连接到乳汁蛋白质基因的调节元件下游，然后将连接产物显微注射到哺乳动物受精卵或胚胎干细胞，当转基因胚胎长成个体后，在泌乳期药用蛋白质基因表达，从动物乳汁可获得基因工程药物。优点：1)采用乳汁蛋白质基因的调节元件调控药物基因的表达,具有组织特异性，基因表达限于乳腺组织；2)表达产物不断随乳汁排出体外,产量高；3)与原核细胞表达系统比较，乳腺细胞具有蛋白质修饰功能，表达产物具有稳定的生物活性；4)蛋白质提取、纯化简单。在经济效益方面，应用转基因动物—乳腺生物反应器技术来制造基因药物也是一种可以获取巨额经济利润的新型产业。英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含有抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。这种病在北美比较常见，病人以前只能依赖于注射人的抗胰蛋白酶做替代疗法，价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售6000美元。如荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。存在问题1)由于药物基因随机整合的位置效应会引起的表达不稳定性；2)对乳汁中蛋白质基因表达的调控机制有待深入了解，尤其是时空特异性表达及激素诱导性表达等问题须进一步探索。动物活体表达系统-动物血液生物反应器外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。大家畜的血液容量较大，利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来，血细胞组分可通过裂解细胞获得。植物表达系统以植物作为基因工程药物表达的受体系统，目前主要用于研制转基因植物疫苗。利用转基因植物生产基因工程疫苗，是将抗原基因导入植物，让其在植物中表达，人或动物摄入该植物或其中的抗原蛋白，以产生对某抗原的免疫应答。转基因植物生产疫苗的研究主要集中在烟草、马铃薯、蕃茄、香蕉等植物。利用植物受体系统表达一般蛋白质药物的研究也已开始，目前我们所认识到的中药有效成分如生物碱、皂苷、糖苷、黄酮等大部分中药是次生代谢产物，可在人工培养过程中有目的地加入已知的有效代谢中间产物、促进剂或抑制剂，增加有效成分的产量。1、转基因植物—抗虫我国的转基因抗虫棉就是转入了Bt毒蛋白基因培育出来的。因为用化学农药防治害虫最大的危害是环境污染，因此可将具有杀虫活性的基因导入到农作物中。1、转基因植物—抗病毒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒抗病毒的转基因小麦1、转基因植物—其他抗逆抗盐碱抗干旱抗涝害抗寒抗除草剂转鱼抗寒基因的番茄抗除草剂基因抗冻蛋白基因转基因植物：提高作物能力，改良农作物的。抗逆品质不会引起过敏的转基因大豆1、转基因植物—改良品质转基因高赖氨酸玉米转基因抗乙肝西红柿(中国)，虽然不能治愈乙肝，但一年只吃几个抗乙肝西红柿，就完全能代替注射乙肝疫苗。抗乙肝西红柿属于转基因食品，就是将乙肝疫苗植入西红柿内，经过多代繁殖，使转入的基因稳定化。用转基因的植物生产药物基因工程药物的安全性及质量检控目前对基因工程操作的后果还存在一定程度的不可预测性和不可控制性，转基因生物有可能隐藏某些危害性。基因工程药物与一般药品不同，它来源于活的生物体，在发酵、细胞培养、产品分离纯化等生产过程有其固有的易变性，导致基因工程药物质量的不稳定性。在制备的基因工程药物中残留的抗生素有可能使病人产生对抗生素的抗药性。用于基因治疗的基因工程药物除了能杀死不正常细胞外可能同时伤害正常的细胞。当用于生产基因工程药物的重组体发生突变或对目的产品进行修饰、纯化时，都有可能产生或带入一些与目的产品相关联的、结构相差甚微而生物活性迥异的变异体。采取的措施：构建基因工程药物表达载体时给目的基因组装诱导型启动子，使其在诱导条件下才能有效表达。构建基因工程药物表达载体时慎用选择标记基因或报告基因，避免生产的基因工程药物中残留对病人有害的物资。尽可能采用外源DNA定位整合载体，避免外源DNA随机整合导致靶细胞基因突变。根据基因工程药物生产和使用的具体情况，逐步完善对此类产品的严格质量控制。基因工程药物的质量检控产品质量鉴定产品生物活性(效价)测定安全性评价稳定性考察产品一致性的保证产品质量鉴定氨基酸成分分析：氨基酸序列分析、末端部分氨基酸序列分析（N端15个氨基酸）可作为基因重组蛋白质和多肽的重要鉴别指标。肽图分析：用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析。它是检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法，该技术有灵敏高效的特点，是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。重组蛋白质的相对分子质量测定纯度分析杂质和污染物检测方法单克隆抗体免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽谱、质谱等微生物微生物学检查支原体微生物学检查病毒微生物学检查基因工程细胞因子类药物1基因工程肽类激素药物2重组溶血栓药物3基因工程酶类药物4基因工程蛋白质类药物重组可溶性受体和黏附分子5细胞因子是指机体细胞合成和分泌的小分子多肽类因子，它们具有调节机体的生理功能和免疫功能，因而有可能利用基因工程技术进行生产，用于治疗肿瘤、感染、免疫低下、造血功能障碍等疾病。目前已研制成功或正在研制的基因工程细胞因子类药物主要有促红细胞生成素(EPO)、集落刺激因子(CF)、干扰素（IFN）、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子、生长因子（GF）和凝血因子（F）等。一、基因工程细胞因子类药物基因重组人促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）EPO是一种主要由肾脏和中枢神经系统等部位合成分泌的多功能糖蛋白激素,是作用于红系祖细胞的造血生长因子，对神经元的许多功能也具有重要的调控作用。EPO是最早发现并首先运用于临床的造血生长因子，1985年成功表达了重组人促红细胞生成素(rhEPO)。rhEPO成为当前研究开发最成功的基因工程药物。在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。EPO的产生与机体供氧状况有关，低氧可刺激EPO的产生。EPO的分子结构和功能天然存在的EPO分为两种类型,α型含35%的糖基,β型含26%的糖基。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类EPO含有166个氨基酸,相对分子质量为34400,hEPO上有4个半胱氨酸(7,29,33,161),在7—161，29—33之间以二硫键相连,这对维持hEPO的生物学活性有重要作用。糖基化对稳定EPO的体内活性具有重要作用,若缺乏糖链,则EPO在体内迅速被水解而失活。促细胞生成素的生物学作用EPO主要通过促进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化以调控红细胞的生成。促进系祖细胞的增殖、分化和成熟调控神经元部分功能对细胞内钙浓度也有明显的调节作用人促红细胞生成素基因重组天然的hEPO制品一般是从贫血病患者尿中提取的，所以药源极为匮乏，不能满足需要。因此，在20世纪80年代就开始rhEPO的研究，从胎儿肝中克隆出hEPO基因,并研制成功rhEPO。1985年美国FDA批准rhEPO作为治疗肾性贫血的药物。研制rhEPO的主要环节包括:获得人促红细胞生成素基因和建立重组人促红细胞生成素的有效表达系统等。hEPO基因由5个外显子（共582bp）和4个内含子（共1562bp）组成。外显子共编码193个氨基酸，包括组成信号肽的27个氨基酸。经人促红细胞生成素cDNA的克隆及其核苷酸序列的测定，hEPO基因天然的核苷酸顺序和相应的氨基酸顺序如图：ATGGGAGTGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCTGMetGlyValHisGluCysProAlaTrpLeuTrpLeuLeuLeuSerLeuLeu-26-20TCGCTCCCTCTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGASerLeuProLeuGlyLeuProValLeuGlyAlaProProArgLeuIleCysAspSerArg-10信号肽-1+110GTCCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTValLeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLysGluAlaGluAsnIleThrThrGlyCysAle2030GAACACTGCAGCTTGAATGAGAATATCACTGTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTATGCCGluHisCysSerLeuAsnGluAsnIleThrValProAspThrLysValAsnPheTyrAla4050TGGAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCCGTAGAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTrpLysArgMetGluVa