蛋白质的共价结构系统

第４章蛋白质的共价结构蛋白质（Protein）1838年，J.J.Berzelius提出，由proteios衍生而来——第一重要，首要的物质蛋白质存在于所有生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，参与了几乎所有的生命活动过程。一、蛋白质通论（一）、蛋白质的化学组成和分类１、元素组成２、蛋白质的含氮量蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。大多数蛋白质含氮量接近于16%蛋白质含量=每克样品中含氮的克数6.25凯氏定氮法３、蛋白质的分类（1）、依据外形分类•球状蛋白质：globularprotein•纤维状蛋白质：fibrousprotein•膜蛋白质：membraneprotein（2）、依据蛋白质的组成分类•简单蛋白simpleprotein单纯蛋白，仅由氨基酸组成•结合蛋白conjugatedprotein由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成简单蛋白•清蛋白和球蛋白albuminandglobulin广泛存在于动物组织•谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱•精蛋白和组蛋白碱性蛋白存在于细胞核•硬蛋白结合蛋白•色蛋白：简单蛋白+色素物质•糖蛋白：简单蛋白+糖类物质•脂蛋白：简单蛋白+脂类结合•核蛋白：简单蛋白+核酸（二）、蛋白质的大小与分子量•蛋白质是分子量很大的生物分子•对任一种给定的蛋白质，其所有分子在AA组成和顺序以及肽链的长度方面都应是相同的，即所谓均一的蛋白质。蛋白质与多肽无严格的界线——通常将6000Dr以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大蛋白质——月示——胨——多肽——肽——AA1*1045*1032*1031000200100-500（三）蛋白质构象和结构的组织层次蛋白质的结构层次一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构高级结构空间构象示例（四）、蛋白质功能的多样性•1.催化功能-酶•2.调节功能-激素、基因调控因子•3.转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白•4.贮存功能-乳、蛋、谷蛋白•5.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白•6.结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架•7.支架作用-接头蛋白•8.防御功能-免疫球蛋白•9.异常功能二、肽（peptide）AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。由两个AA组成的肽称为二肽。由多个AA组成的肽则称为多肽。组成多肽的AA单元称为氨基酸残基。CCNCCNCCNCCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽键•多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序•含游离-氨基的一端：氨基端或N-端含游离-羧基的一端：羧基端或C-端•AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln（一）、肽和肽键的结构①肽键中C-N键有部分双键性质——不能自由旋转②组成肽键原子处于同一平面（肽平面）③键长及键角一定④大多数情况以反式结构存在共价主链（二）、肽的物理化学性质•肽末端α-羧基pKa值比游离AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游离AA中的小。•等电点（两性）。•酸碱性质取决于：—α-羧基、α-氨基、侧链基团的解离•具有双缩脲反应——Pr特有的反应。（三）、天然存在的重要多肽NHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2CH3COOOOCH2CH2SOOH鹅膏覃碱的化学结构三、蛋白质一级结构的测定什么是Pr的一级结构？蛋白质中氨基酸的排列顺序。•1.样品必需纯（97%以上）•2.知道蛋白质的分子量•3.知道蛋白质由几个亚基组成•4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量计算每种AA的个数•5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量前提（一）、蛋白质测序策略(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目•通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略(2)多肽链的拆分蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略•几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。•可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略(3)断开二硫键•在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略蛋白质一级结构的测定(4)测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比（一）、蛋白质测序策略(5)分析多肽链的N-末端和C-末端(6)多肽链断裂成多个肽段•采用两/多种不同的断裂方法将多肽断裂成两套或多套肽段，并将其分离。蛋白质一级结构的测定（一）、蛋白质测序策略(7)测定每个肽段的氨基酸顺序蛋白质一级结构的测定(8)确定肽段在多肽链中的次序利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。（一）、蛋白质测序策略(9)确定原多肽链中二硫键的位置。蛋白质一级结构的测定•两类多肽链末端氨基酸残基：N-端氨基酸C-端氨基酸•在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸残基测定•Sanger法1、末端分析二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定N碱性条件二硝基苯衍生物黄色•二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高丹磺酰氯（DNS）法N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析1N(DNS-aa)苯异硫氰酸酯（PITC)法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析1N—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF苯异硫氰酸酯PITC•肽链外切酶:从多肽链N-端逐个向里水解•根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量，按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线蛋白质N-末端残基顺序。•最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶—水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。④氨肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析1N•肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质①肼解法H2NCHCROHNCHCROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析2C（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析2CC末端AAα氨基醇②还原法硼氢化锂•肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解•根据不同反应时间释放出的AA种类和数量蛋白质C-末端残基顺序。•四种羧肽酶：A,B,C和Y；A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母)•∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基∽B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键③羧肽酶法（二）、末端氨基酸残基的鉴定、末端分析2C（三）、二硫键的断裂•盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价力。•应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。1、酸水解（四）、氨基酸组成的分析2、碱水解1、酶解法:•内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶•外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽链的选择性降解（五）、多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化•R1=Lys（K）和Arg（R）•专一性较强，水解速度快•R2=Pro（抑制）肽链水解位点胰蛋白酶trypsin•R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA•Leu、Met和His稍慢•R2=Pro（抑制）•pH8-9肽链水解位点糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度与相邻AA性质有关:酸性：-/碱性：+•R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快肽链水解位点R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜热菌蛋白酶（thermolysin)•R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快•R1=Pro（抑制）•pH2肽链水解位点胃蛋白酶Pepsin肽链水解位点羧肽酶和氨肽酶2、化学裂解法①溴化氰水解法(Cyanogenbromide)——选择性地切割由Met羧基形成的肽键。CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCNCH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高丝氨酸内酯（五）、多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化多肽链的选择性降解②NH2OH断裂：较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂3、肽段的分离纯化：凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法N-端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。1、Edman法（六）、肽段氨基酸序列的测定（苯异硫氰酸酯法）Edman于1950年首先提出。PITCPTC-肽2、氨肽酶法或羧肽酶法3、质谱法（MS）灵敏度高、所需样品少、测定速度快核糖体蛋白质链4.根据核苷酸序列的推定法（七）、肽段在多肽链中次序的决定重叠肽（overlapingpeptide）•胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链•经电泳分离各肽段•用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90℃二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化•然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置（八）、二硫键位置的确定胃蛋白酶•最适pH约2，此时二硫键不断开•专一性低、肽段短（九）、蛋白质测序举例（十）蛋白质序列数据库同源蛋白质：来自不同生物体、执行同一/相似功能的蛋白质同种蛋白质：来自相同生物体、执行同一功能的蛋白质1、同源蛋白质四、蛋白质的AA序列与生物功能（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化一百多个AA残基MW约12.5×10328个不变残基细胞色素C的AA序列差异可用于核对各物种间的分类学关系以及绘制系统树/进化树。2、细胞色素C与系统树invariantresidues(yellow)conservativesubstitutions(blue)nonconservativeorvariableresidues(unshaded)Conservationandvariationofcytochromecsequences1、氧合血红蛋白（二）同源蛋白质具有共同的进化起源•该酶类活性中心的Ser残基起关键作用•胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶和纤溶酶•有序列同源性•对底物偏爱不同2、丝氨酸蛋白酶类卵清中的溶菌酶（lysozyme）α-乳清蛋白（lactalbumin）——三级结构很相似也可能具有共同的祖先。3、一些功能差异很大的蛋白质（三）血液凝固与AA序列的局部断裂凝血酶原血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。可溶性的血纤蛋白原酶有活性的凝血酶不溶性的血纤蛋白网（一）肽的人工合成保护（氨基、羧基、侧链活性基团）活化（氨基、羧基）缩合剂（二）胰岛素的人工合成（三）固相肽合成五、肽与蛋白质的人工合成