基于CHO细胞的单抗生产2

基于CHO细胞的单抗生产（第一版）汪洋2018/0215:21提高原料药出料工序收率2/40•CHO细胞的构建•CHO细胞的表达•CHO细胞表达后的产物纯化目录15:213/40第一节CHO细胞的构建生物类似药的开发周期表引言15:215/40在获取一种蛋白之前，先要找到该蛋白的基因序列，我们知道了它的名字，就可以到数据库里进行搜索。有很多免费的数据库资源，比如NCBI。找到蛋白，再找到它的DNA序列。然后针对这段序列设计引物，找到模板或基因组，用PCR的方法扩增出来把扩增出来的基因放到载体上，通过一定的方式如电刺激使得载有可表达目标蛋白的载体进入到细胞内部由于转入细胞核的质粒有很小的概率（亿分之一）整合进宿主的基因组中，所以可以用加压筛选的手段（主要有抗生素）将这种细胞筛选出来并扩大培养，这样就得到了可以稳定表达目标蛋白的细胞株工程细胞构建的流程概述细胞株筛选一般流程a.宿主细胞b.载体c.筛选CHO细胞系宿主的一般来源1.FUT8（α-1,6岩藻糖转移酶基因），负责将岩藻糖加入抗体的N-糖链上，形成岩藻糖修饰（专利日本BioWa制药，预计2028.07.09）。去除岩藻糖修饰可以增强百倍以上的ADCC作用。2.crispr/cas9原理是：crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activatingRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（singleguideRNA），足以引导Cas9对DNA的定点切割。3.锌指核糖核酸酶（ZFN）由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。宿主细胞选择的一般原则Regulatory-HostcelllineIND提供CHO已知具有明显的致瘤性，一般可不再检测宿主细胞选择的一般原则载体的一般性构成主要构件：IRES起始位点Promoters启动子Enhancer增强子Signalpeptide信号肽mAbSequence单克隆抗体序列Terminator终止子Resistancemarkers抗性标记Expressionpromotingelement促稳定表达件载体的一般性构成1、IRES：即内部核糖体进入位点，是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5‘帽结构，从而使直接从信使RNA（mRNA）中间起始翻译成为可能。通常来讲，真核生物翻译只能从mRNA的5‘端开始，因为翻译起始必须依赖于5’端的帽子结构。2、Promoters：即启动子，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子（transcriptionfactor）的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的抗体序列需使用强启动子如SV40启动子等而抗性基因需要使用削弱的启动子3、Enhancer：即增强子，是指能够使基因转录频率明显增加的DNA序列。增强子主要存在于真核生物基因组中。增强子能大大增强启动子的活性。增强子具有特异性载体的一般性构成4、Signalpeptide：即信号肽（引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链）不同的产物可能需要不同的信号肽，抗体一般可使用人血白蛋白信号肽，获得较高表达量，且能被完全切除一般需要进行信号肽预测优化，选择合适的信号肽，在蛋白质分泌到胞外之前正常情况下会被完全切除信号肽假说认为，信号肽的功能是引导多肽到达内质网内腔，同时信号肽酶水解，加工完成后分泌到胞外5、mAbSequence人源化IgG1恒定区（CH和CL）有EM和DL两个版本，区别是两个位点的氨基酸有突变Biosimilar:检索原研药专利获得VH和VL序列，并购买原研药进行序列分析比对，进行序列验证Category1ofTherapeuticBiologicalProducts:①Hybridomatechnique杂交瘤筛选②Phagedisplay噬菌体展示载体的一般性构成6、Terminator：终止子，是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵元中至少在构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。7、Expressionpromotingelement:即促表达元件例：UCOE:全称为泛染色质开放元件（UbiquitousChromatinOpeningElement），加在外源基因启动子5’端上游，是一个小的DNA片段，源于看家基因的无甲基化CpG岛。研究表明，UCOE能有效防止基因沉默，不论整合到染色质什么位置，目的基因都能持续稳定、高水平地表达。MerckKGaA专利，预计2019.07.20到期载体的构建的一般性原则构建完的细胞筛选非扩增基因扩增基因：在一定程度上表达量随筛选压力而增加可选其中一种或选其中任意两种，使用两种需要关注HC和LC比例（LC形成二聚体可以分泌到胞外）筛选方法Fluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)-BasedScreening基于荧光激活细胞分选(FACS)技术的筛选方法ClonePix/CellXpressTM克隆筛选及细胞表达系统Limitingdilution有限稀释法筛选方法Fluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)-BasedScreeningThecoldcapturemethodusedinFACSwherefluorescentlylabeledantibodiesbindtosecreted将待测的细胞经荧光染料(FITC、PE和PerCP等）或荧光标记物特异性染色,用特定波长的激光束照射,激发荧光。前向角光散射(forwardanglelightscatter,FSC)和侧向角光散射(sideanglelightscatter,SSC)分别表征细胞的相对大小和内部颗粒度,相对荧光强度值能反映细胞目标的相对表达水平光源筛选方法ClonePixSemisolidmedia筛选方法Limitingdilution有限稀释法(limitingdilutioncloning,LDC)是一种通过梯度稀释以获得单克隆的方法。它的应用范围广,对于大多数细胞类型,如杂交瘤细胞、CHO细胞及干细胞等都有较好的克隆分离效果。LDC的操作过程大致分为接种(铺板)、筛选和扩增。接种的细胞液经过逐级稀释后加到96孔板中,每个孔所含的细胞个数理论上不大于1有限稀释法ExpressionVectorHostcellTransfectionMinipoolStablepoolSmall-scalBioreactorMonoclonalSubclone一二SubcloneSmall-scalBioreactor转染转染①脂质体转染法：阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染后需要更换培养基。如Lipofectamine™3000TransfectionReagent，一般用于瞬时转染，因转染后细胞活率较高，也有部分企业用于稳转。②电穿孔转染法：电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内，这种方法就是电穿孔。因使用便捷且转染（入核）效率较高，大部分企业使用电转染。电转染有两种方案：方形波和指数波，根据实际情况选择合适的波形进行优化，选择转染效率和转染后细胞活率较高的电转条件。CHO细胞选用电转较多。③病毒感染：对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染的细胞系建议用病毒感染，此法可以快速100%感染，检测成功率高。因操作难度高，使用较少。克隆筛选一、Minipool转染24H后,使用含有压力的培养基，以一定细胞密度接种到96WP,培养14-20天，挑选出只有单簇细胞生长且汇合度超过30%的孔，ELISA检测表达量，挑选表达量较高的若干个克隆96WP24WP6WPELISATPPSF125接种F125进行Fed-Batch评估，检测表达量和质量，选择产量和质量最优的3-5个克隆MonoclonalELISA、SDS-PAGE(还原与非还原)表达量检测还可用：Dot-blot、FortebioELISA克隆筛选二、Stablepool转染24H后,使用含有压力的培养基，以一定细胞密度接种到T75或F125,加压一定时间（根据使用的筛选压力），得到若干个Stablepool，用ELISA（或FACS）检测，选择表达量（或阳性率和高表达）的1-2个Stablepool进行单克隆化Stablepool96WP24WPTPPSF125接种F125进行Fed-Batch评估，检测表达量和质量，选择产量和质量最优的3-5个克隆Monoclonal以1-3个/孔铺板96孔板进行单克隆化，一般不添加筛选压力或者使用半压6WPELISAELISAELISA、SDS-PAGE(还原与非还原)单克隆在细胞克隆中，对培养的细胞来说，从原有的克隆中，再筛选出具有某种特性的细胞进行培养，就是亚克隆。亚克隆的目的是获得单克隆CFDA-目前来说只要理论上证明是单克隆FDA-ClonalityLimitingdilution：classic0.5cell/well2roundsCSI/CellMetric单克隆拍照系统FDA目前对于单克隆证明方法意见克隆性FISH不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。筛选检定细胞代次的规定细胞库的相关法规要求细胞库的相关法规要求1、程序性降温仪：可编程降温程序，能够准确的达到设定的温度，重复性。稳定性好，适合于细胞建库使用2、程序降温盒：需在降温盒夹层加入异丙醇，可实现-1℃/min，每个冻存盒一般可放16支，比较适用于实验室规模标准的冻存程序：为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。细胞库的相关法规要求冻存容器：（供应商:CBS、MVE、ThermoFisherScientific）普通液氮罐：直接冻存在液态液氮中，很容易引起交叉污染气化液氮罐：液氮存于罐底部，通过底部液氮气化维持温度隔氮型液氮罐：液氮贮存于夹层中，与样品完全隔离，取用安全且将交叉污染的可能降到最低细胞库的相关法规要求细胞库的检定细胞库检定-CHO细胞检测项目MCPWCPEOPC细胞鉴别++(+)细菌、真菌检查+++分歧杆菌检查+++支原体检查(+)(+)(+)内、源病毒污染检查细胞形态观察及血吸附试验+++体外不同细胞接种培养法+++动物和鸡胚体内接种法+-+逆转录病毒检查+-+种属特异性病毒检查（鼠源）(+)--牛源性病毒检查(+)(+)(+)猪源性病毒检查(+)(+)(+)其他特定病毒检查(+)(+)(+)染色体检查(+)(+)(+)成瘤性检查(+)(+)-致瘤性检查(+)(+)-(+)表示要根据细胞特性、传代历史、培养过程等情况要求的检链项目。细胞库的稳定性考察细胞稳定性研究储存条件下的稳定性传代/扩增过程的稳定性基因水平目的产物表达水平细胞自身稳定性细胞库的稳定性考察储存条件下稳定性属于原液放行检定项目细胞库的稳定性考察传代/扩增过程的稳定性通过细胞构建减少表达杂质的案例CHOK1cellExpressionofantibodyAAcidicvariants:NMT14.0%Basicvariants:NMT30.0%USPAcceptancecriteriaAcidicvariants:NMT35.0%Basicvari