总RNA提取--常用方案

试剂盒快速提取实验方法原理GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA，则根据Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。实验材料微生物动物细胞植物组织试剂、试剂盒RNA提取试剂盒焦碳酸二乙酯乙醇仪器、耗材恒温水浴冷冻高速离心机紫外分光光度计取液器电泳仪电泳槽实验步骤一、细胞或组织破碎1.微生物材料（1）发酵3~4天（或对数生长期）的菌体，离心收集菌丝体（动植物材料无需此步处理）。（2）用经DEPC处理的水洗菌丝体2~3次，并尽量除去残存的水。（3）加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA。（4）研磨后的样品转移至12ml变性液的容器中匀浆。2.动植物细胞培养材料（适用的样品量为细胞：108）（1）细胞或组织培养：按常规方法进行。（2）深层悬浮培养细胞的破碎。①细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4℃，3000g离心5分钟。②细胞洗涤：上步沉淀用25ml灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤，然后4℃，3000g离心5分钟。③细胞破碎：在沉淀细胞中加入15ml预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆。3.表面培养细胞的破碎（1）确定培养瓶数量，使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108。（2）细胞收集：将培养液倒掉，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次，在培养瓶中加入8ml预冷变性液。（3）转动培养瓶，使细胞溶解，此时可见粘度加大。（4）用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶，旋转，溶解细胞，再吸入第三个培养瓶，以此类推。（5）直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次，然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液，将所有培养瓶洗一次。（6）将上述12ml含细胞的变性液转移至一50ml无菌离心管中，匀浆破碎细胞。4.植物组织破碎（适用的样品量为0.05g组织）（1）将600ul变性液置于1.5ml离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。（2）将0.05g新鲜组织用液氮冰冻。（3）在液氮下，研磨组织块。（4）待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中。5.动物组织破碎（适用的样品量为1g组织）（1）将12ml变性液置于50ml离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。（2）在上述管中加入1g新鲜或冰冻动物组织，匀浆粉碎。二、RNA的抽提1.在经变性液匀浆的细胞或组织600ul+60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。2.600ul酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。3.冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10000g，20分钟。4.上层水相吸至无菌离心管中加等体积的异丙醇，-70℃，30分钟沉淀RNA。5.离心4℃，10000g，20分钟。6.沉淀RNA，冷冻干燥15分钟，RNA沉淀重新溶于300ul变性液中，可振荡（有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短）。7.60ulpH4.0的2M乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。8.600ul酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。9.冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10000g，20分钟。10.上层水相吸至无菌离心管中。11.等体积异丙醇二次沉淀（-70℃，30分钟），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥。12.复溶于去RNA酶的水中（对于准备长期保存的RNA可加入pH5.0的乙酸钠至终浓度为0.25M，再加入2.5体积的乙醇，-70℃保存。）。展开注意事项1.研磨组织块用于RNA提取的样品，必须是新鲜的细胞或组织，如采样后，不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。2.变性液及相应的离心管需预冷。其他1.变性液组成25g异硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mMpH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2mMβ-巯基乙醇)，65℃溶解，过滤灭菌，4℃预冷。2.酸性酚配制55℃时，500g酚溶入500ml50mM，pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500ml50mM，pH4.0乙酸钠，直到pH4.1。氯化锂提取法实验方法原理用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片断丢失的缺陷。实验材料微生物动物细胞植物组织试剂、试剂盒氯化锂尿素Tris-HCLEDTASDS仪器、耗材恒温水浴冷冻高速离心机紫外分光光度计取液器电泳仪电泳槽实验步骤一、组织或细胞匀浆1.对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5~10ml氯化锂-尿素溶液，匀浆器高速匀浆2分钟。2.对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂—尿素溶液手工匀浆，并转移至Eppendof管中。二、纯化1.匀桨液在0~4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。2.取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂—尿素溶液，重复步骤1。3.沉淀用原匀浆液1/2体积的氯化锂—尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15~30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。4.取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，-20℃放置1小时，5000g离心。5.70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥。6.RNA溶解液溶解沉淀，得RNA。三、保存分装，于-70℃保存。一步法实验材料RNA试剂、试剂盒乙酸钠氯仿异戊醇异丙醇乙醇SDS酚仪器、耗材离心机分光光度计摇床实验步骤1.组织来源材料：100ng组织加1μl变性液，在玻璃Teflon匀浆器中将其匀浆。2.培养细胞：离心弃悬浮细胞培养液或倒去单层培养细胞培养液（不需用生理盐水洗涤），每107细胞加入1ml变性液，然后用吸管抽吸7~10次。3.将匀浆移入5ml聚丙烯管子，加入0.1体积的2mol/lpH4.0的乙酸钠缓冲液，混匀。4.加入1ml水饱和酚，混匀；再加入0.2体积的49：1氯仿/异戊醇。5.混匀后0~4℃放置15min。6.于4℃用SS-34转子10000g离心20min，将上层水相移入一个干净试管中。7.加入1ml（等体积）异丙醇-20℃放置30min沉淀RNA，于4℃10000g离心10min。8.将RNA溶解于0.3ml变性液，并移入1.5ml微量离心管中，加0.3ml异丙醇,。9.-20℃放置30min沉淀，于4℃10000g离心10min。10.重悬RNA沉淀于75%乙醇，旋起沉淀，室温放置10~15min，10000g离心5min。11.真空干燥RNA5~10min，溶解沉淀于100~200μlDECP此处理过的水或DEPC处理过的0.5%SDS，-70℃冰冻保存或保存在-20℃的乙醇中。CsCl法实验材料RNA试剂、试剂盒PBS异硫氰酸胍CsClDEPC无水乙醇仪器、耗材注射器电泳仪离心机培养箱实验步骤一、用于单层培养细胞1.室温下用PBS冼涤细胞，每平皿用5ml，洗2次。2.在不超过108细胞中加入异硫氰酸胍溶液，并使之遍布整个平皿。3.用橡皮细胞刮子擦刮平皿，回收粘稠的细胞裂解液。4.用装有20-G针头的皮下注射器往返抽吸裂解物，并合并在一起。二、用于悬浮培养细胞1.用JS-4，2转子离心回收≤108细胞，重悬于相当于1/2原有体积的PBS，并再次离心回收细胞。2.往离心管中加入3.5ml异硫氰酸胍溶液。3.用装有20-G针头的6注射器将粘稠的细胞裂解液注返抽吸4次，并将其移至一个干净的试管中。4.在经硅化并高压过的13mm×51mm的异质同晶聚合物超离心管中，加入1.5ml5.7mol/lCsCl。5.并在此垫层上加入3.5ml细胞裂解液，界面应清晰。6.于18℃用BeckmanSW-55转子150000g离心12~20h（缓慢加速和减速）。7.用巴斯德吸管的管尖在液面上吸取上清，管子随液面的下降而下降。8.当吸至仅剩约100μl时，小心倒置管子，倒出剩余液体。9.晾干沉淀约5~10min，然后以360μlTES溶液重溶沉淀，反复地以吸管上下抽吸。10.如此在室温进行5~10min，转移溶液于另一干净的微量离心管。11.加入40μl3mol/lpH5.2的乙酸钠缓冲液和1ml无水乙醇。12.在干冰/乙醇中沉淀30分钟，离心10~15min，用360μl水重溶沉淀并重复沉淀过程。13.让沉淀晾干10min，溶解于200μl水，取10μl稀释至1ml测A260和A280。14.以水溶液或乙醇沉淀的形式在-70℃贮存RNA。收起注意事项1.1~5步的操作均在室温进行。