Module4定量PCR实验设计和流程

Module4Module4::定量定量PCRPCR实验设计和流程实验设计和流程张远涛Ph.D,SrFASHotline:4008208982/[e-mail]2实时定量实时定量PCRPCR介绍介绍3实时定量实时定量PCRPCR一种定量检测核酸靶序列的方法•基因表达•siRNA敲除•Microarray结果验证•miRNA表达•病毒/细菌定量•基因拷贝数•CNV•转基因学(纯合vs.杂合)•染色质免疫共沉淀(ChIP)•甲基化研究•其他……4定量数据好的三个基本条件：定量数据好的三个基本条件：•精密度好•准确度高•动力学范围宽51.1.精密度精密度::曲线一致性曲线一致性重复性好40个相同样本重复62.2.准确度准确度::与正确检测数据的接近程度73.3.动力学范围动力学范围能得到高质量数据的浓度范围(范围越大越好)8CtCt值值（（CyclethresholdCyclethreshold））每条扩增曲线穿过阈值线对应的循环数.曲线穿过阈值线时对应的循环数为23.19重要问题重要问题定量实验中，单独的Ct值本身有意义吗？答案:没有.需要将Ct值转化成有意义的数值ZILCH!410制作标准曲线制作标准曲线104103102101100已知浓度的标准品做梯度稀释11反应结束时，将未知反应结束时，将未知CtCt值在曲线上比对值在曲线上比对Standard/dilutionamt.Cycles(Ct)Qty=250110,000100010010未知Ct12#1#1用户进行实时定量用户进行实时定量PCRPCR时会出现的错误时会出现的错误生成不准确的标准曲线(因此造成不准确的扩增效率计算)613如何制备标准曲线如何制备标准曲线•Don’t:−制备3个点的2倍标准曲线.•Do:−制备至少5个点的10倍标准曲线(4logs).−去除离散的重复孔，或者有必要时去除整个梯度数据.614包含异常值的标准曲线包含异常值的标准曲线Betterthanperfect!615检查相关系数检查相关系数6Shouldbe≥0.9916去除离散值的点去除离散值的点选择离散的孔，右键点击，去除.617如何制备标准曲线如何制备标准曲线•每次实验用多个样本分别做曲线•寻找结果之间的一致性.•如果曲线斜率达不到要求，检查错误的原因。（稀释操作不准确？移液器没有校准？）−注意:实验本身的效率是恒定的(假设模板质量好，仪器功能正常，以及使用合适的试剂等等)618Whatifyouhatestandard/dilutioncurves?19实验案例实验案例•目前有3个质量相同的葡萄•关注点:3个葡萄可能被E.coli污染•从每个葡萄中提取DNA•接着设计特异性检测E.coli的定量PCR实验•对3个葡萄样本的DNA进行PCR扩增.−反应板上未设标准曲线!20结果结果::能进行定量吗？能进行定量吗？28葡萄葡萄11循环数循环数2930葡萄葡萄22葡萄葡萄3321是的是的!!因为每经过因为每经过11个循环个循环PCRPCR产物加倍产物加倍......28葡萄葡萄11循环数循环数2930葡萄葡萄22葡萄葡萄33ΔΔCt=1Ct=122倍差异倍差异22相对比较的简单数学关系相对比较的简单数学关系ΔCt为1=2倍差异ΔCt为2=4倍差异8倍差异ΔCt为3=10倍差异ΔCt为=3.323形成这种数学关系的前提形成这种数学关系的前提•每经过1个循环，产物的量会加倍−在这种情况下，反应的扩增效率为100%扩增效率：每个循环中靶分子被作为模板利用的百分比24如果扩增效率为如果扩增效率为100%100%100%100%1010--fold=3.3cyclesfold=3.3cycles2831.31000100425然而然而,,如果扩增效率下降如果扩增效率下降……100%100%1010--fold=3.3cyclesfold=3.3cycles2831.3100010080%80%1010--fold=fold=3.93.9cyclescycles3336.9这种简单的数学关系不再成立!26反应的扩增效率为反应的扩增效率为100%100%的优点的优点•可使用简单的数学关系(dCt为1=2倍差异，等等）•不需要标准曲线来计算相对起始量•实验的敏感性被最大化，曲线越陡越早被检测27什么原因会导致扩增效率达不到什么原因会导致扩增效率达不到100%100%??重要问题重要问题28一一种原因种原因::样品不纯样品不纯•如果样品包含PCR抑制剂，反应会减慢，甚至不反应。•这种情况常见于来自生物制品样本的核酸。cDNA作为起始模板时很少见，特别是如果逆转录后模板已被稀释。29重要信息重要信息•如果样品指数扩增期与其他样品或标准品不平行，则得到的Cts值或定量值不准确！30其他原因：引物设计不当其他原因：引物设计不当•扩增产物太长−实时定量PCR检测建议扩增产物序列长度为50-150碱基•没有选择合适的引物退火温度•设计的引物有错配•模板序列特殊（比如：GC含量高）31如何得到高效率的实验如何得到高效率的实验5TBC:TooBeContinued…laterinslidedeck32定量实验流程定量实验流程6一步法vs.两步法5’-NucleaseSYBR®IGreen33定量实验流程定量实验流程634首先看流程第一步：采集样本首先看流程第一步：采集样本635潜在的问题潜在的问题•细胞死亡时RNA迅速被RNases酶降解•另外，样本（组织，血液等）一旦离开机体后，基因表达谱会发生改变•可能的解决方案：−将样本迅速完全融解在有机溶剂中（比如：Tri-Reagent）−液氮冻存−将组织/细胞存放在稳定的溶液中636RNAlaterRNAlater™™•无毒的组织防腐剂和RNA稳定剂637流流程程638RNA来源于培养的细胞:无需RNA提取!最新!!!SYBRGreen®Cells-toCTTMKit39三种主要类型三种主要类型•有机溶剂法−提取的样本纯度高−劳动强度大•过柱法(玻璃纤维过滤)−简单，各种样本类型都能提取到纯RNA•磁珠法−产量高，洗脱体积小−不需要离心，适合高通量提取640AmbionAmbion:TheRNACompany:TheRNACompany641AmbionAmbion:TheRNACompany:TheRNACompany642643传统RNA提取方法vsCells-to-CT™流程去除基因组DNA结合总RNA25-30分钟(*样品越多时间越长)裂解加乙醇洗涤(3X)洗脱RNA7分钟裂解细胞+DNase酶(5min)终止剂(2min)提取的RNA可直接用于标准和快速模式的实时定量PCR44能否从微量能否从微量RNARNA样本中检测低表达基因？样本中检测低表达基因？•福尔马林浸泡，石蜡包埋组织•激光捕获显微切割样本•穿刺活检样本•速冻组织样本•单细胞45预扩增预扩增RNAcDNA将RNA逆转录成cDNA利用TaqMan®方法进行实时定量PCRTaqMan®Assayspool预扩增cDNARNAcDNA将RNA逆转录成cDNA利用同样的TaqMan®方法进行实时定量PCR传统的基因表达分析包含预扩增的基因表达分析46预扩增流程预扩增流程10or14PCR循环1:5or1:20稀释上机检测AppliedBiosystemsReal-TimePCRSystemPooledTaqMan®GeneExpressionAssaysIndividualTaqMan®GeneExpressionAssayscDNA加入量1-250ngTaqMan®PreampMasterMixTaqMan®GeneExpressionMasterMix47其他因素其他因素•根据以下几个方面选择合适的样本提取方法−样本类型(血液,FFPE组织,细胞,纤维组织或软组织,等).−分离的RNA类型(比如：需要小RNA吗？).−应用领域是否需要高纯度RNA（用于实时定量PCR检测）？是否需要最大产量？−通量需求（高，中，低）648不要忘记进行不要忘记进行DNaseDNase酶处理！酶处理！649流流程程65’-NucleaseSYBR®IGreen50TaqManTaqMan®®orSYBRorSYBR®®GreenIGreenI染料染料??•优势−更特异−不需要考虑二聚体−可以进行多重反应−不需要优化−拥有数百万种已开发的试剂盒•不足−比较昂贵•优势−比较便宜•不足−特异性差−需要做融解曲线−不能进行多重反应−需要进行优化−必须自己设计实验（根据生物信息学）TaqMan®Sybr®GreenI651流流程程6Wewilltalkaboutthislater5’-NucleaseSYBR®IGreen52流流程程65’-NucleaseSYBR®IGreen一步法vs.两步法53RNARNA处理处理……•首先cDNA合成•选择一步法vs两步法进行逆转录PCR将RNA逆转录成cDNA扩增并定量cDNA(基因特异性引物)单管一步法RNAcDNA54一步法一步法RTRT--PCRPCR•将未知RNA直接加入到实时定量PCR反应管中•接着，加入含逆转录酶和Taq酶的反应液•RT反应完成后，立即进行PCR−优势：节省加样步骤−注意点:样品反复冻融会造成RNA降解（小量等份分装）55两步法两步法RTRT--PCRPCR•先将RNA逆转录成cDNAs•然后，将cDNAs1:2–1:10稀释（任意选择）•加入反应板中，实时扩增cDNA，或-20ºC储存（稳定保存数周）−优势：cDNA远比RNA稳定，可以反复冻融多次−不足：和一步法相比，需要更多的加样步骤56步骤1:将RNA逆转录成cDNA(随机引物/oligodT)步骤2:扩增并定量cDNA(基因特异性引物)多管两步法cDNARNA选择一步法vs两步法进行RT-PCR57逆转录逆转录(RT)(RT)cDNA合成•一步法vs两步法RT-PCR−两步法RT-PCR：用于基因表达研究敏感性高容易标准化−一步法RT-PCR：适合于特殊应用比如：病毒RNA检测•逆转录引物−随机引物Ö建议用于基因表达研究−OligodTÖ不能18SrRNA−使用随机引物和OligodT的混合物−基因特异性引物对于降解或片段化的样本有用通常进行多次相同实验58•逆转录酶的选择根据应用和模板进行选择−应用:miRNA，基因表达或病毒研究−模板:如果存在二级结构，选择在高温有活性的酶−MultiScribe™逆转录酶逆转录活性温度范围：37°C-45°C−rTth聚合酶60°C有逆转录活性,Mn2+作为辅因子同时也具有聚合酶功能(一步法RT-PCR)−HIV逆转录酶在50°C有活性逆转录逆转录(RT)(RT)cDNA合成59•逆转录反应的效率−尽量使逆转录反应标准化−尽可能所有样本平行试验−选择最合适的温度进行逆转录•逆转录反应的线性和效率验证−选择有代表性的样本检测RNA加入量范围，比如：10ng–2µg−进行实时定量PCR反应检查线性检查逆转录效率−计算进行逆转录最合适的RNA量•重复性验证−选择相同的RNAs多次重复进行逆转录−选择相同的温度进行实验操作逆转录逆转录(RT)(RT)cDNA合成60病毒病毒RNARNA分析分析一步法RT-PCR操作步骤总RNA•基因特异性引物和TaqMan®探针或基因特异性引物(SYBR®Green)•无核酸酶水(或RT-PCR级水，确保无细菌和基因组DNA污染)•一步法RT-PCRMasterMix:•优化的缓冲液体系•相对参比染料•dNTPs•MgCl2•逆转录酶•DNA聚合酶•用光学膜或盖子密封反应板/反应管•离心反应板•进行一步法RT-PCR•实时监测荧光信号•结果分析61病毒RNA分析方法:一步法病毒RNATaqMan®SYBR®Green实时荧光定量PCR逆转录反应样品准备TaqMan®RNA-to-CTTM1-StepKitPowerSYBR®GreenRNA-to-CTTM